非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌分離株的多位點(diǎn)序列分型研究＊

白向?qū)?，趙愛蘭，夏勝利，熊衍文，徐建國

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin－producing Escherichia coli，STEC）是一類重要的食源性病原菌，可引起水樣腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征（Hemolytic－uremic syndrome，HUS）等病死率高的疾?。?］。自1982年美國首次報(bào)道由O157∶H7引起的暴發(fā)以來，世界各國相繼報(bào)道了不同血清型的STEC散發(fā)感染和暴發(fā)［2－5］，其中以 O157∶H7血清型為主。目前發(fā)現(xiàn)有超過200種非O157血清型的STEC能引起人類疾?。?］。在對全球35個(gè)國家的腸道感染病例監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，2002－2005年非O157STEC感染率上升了60．5%，而 O157 STEC只有13%的上升［7］。特別是2011年5月，德國出現(xiàn)一起由O104∶H4感染引起的暴發(fā)疫情，共造成4 075人發(fā)病，其中50人死亡（WHO，2011年7月22日數(shù)據(jù)），提示未來非O157STEC的流行或暴發(fā)可能會成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)重要問題。

早在1998年世界衛(wèi)生組織就已提出將非O157 STEC的快速檢測作為公共健康的首要問題之一（WHO，1998）。美國自2001年起開展了對非O157STEC感染的主動監(jiān)測，非O157STEC感染的報(bào)告病例逐年上升［4］。歐盟于1998年通過了人感染STEC病例報(bào)告的相關(guān)法案。2005－2009年歐盟國家每年報(bào)告的STEC感染病例數(shù)在3 000例左右，其中非O157感染病例近二分之一［8］。我國1999年蘇皖出現(xiàn)O157∶H7感染大暴發(fā)，為此2000年衛(wèi)生部發(fā)布了《全國腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染性腹瀉監(jiān)測方案（試行）》，加強(qiáng)了我國重點(diǎn)地區(qū)的O157∶H7的監(jiān)測工作，但目前我國尚未系統(tǒng)開展非O157STEC感染調(diào)查和病原菌檢測工作。本研究通過對我國分離的部分非O157STEC菌株進(jìn)行血清型鑒定、主要毒力基因檢測及分子分型分析，旨在初步了解我國這類菌株的分子流行病學(xué)特征和遺傳背景。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源 28株非O157STEC菌株2002年4－8月分離自河南某波爾山羊場羊糞，1株2009年分離自黑龍江某農(nóng)村肉牛糞。菌株經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所新病原室復(fù)核和O157及H7血清型鑒定排除后－80℃保存。

1．1．2 主要試劑與儀器 大腸桿菌O及H抗原全套血清購自丹麥血清學(xué)研究所（Statens Serum Institut，Denmark），致病性大腸桿菌O抗原診斷血清購自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；La Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs及DL2000 DNA Marker購自大連TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒（Bacteria Gene DNA kit）購自康為世紀(jì)公司。PCR儀（SensoQuest Labcycler）購自德國Senso公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc2000）購自美國Bio－Rad公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；PCR產(chǎn)物純化及測序由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1．2 方法

1．2．1 血清型鑒定 O血清型鑒定使用丹麥血清研究所和天津生物芯片有限公司生產(chǎn)血清套裝，鑒定步驟按照說明書進(jìn)行。H血清型的分型首先采用fliC基因全長引物（見表1），PCR擴(kuò)增后測序，根據(jù)序列比對結(jié)果判定型別，最后以H抗原診斷血清復(fù)核。

1．2．2 DNA模板的制備 細(xì)菌基因組提取按試劑盒說明書進(jìn)行，制備好的模板置－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 毒力基因檢測 對29株菌的3個(gè)毒力基因stx1、stx2、eaeA進(jìn)行PCR鑒定。PCR引物序列及產(chǎn)物大小見表1，PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃15 min，變性94℃30s，退火57℃90s，延伸72℃90s循環(huán)30次，最后72℃ 延伸10min［9］。

1．2．4 管家基因擴(kuò)增 根據(jù)E．coli MLST數(shù)據(jù)庫（http：／／mlst．ucc．ie／mlst／dbs／Ecoli）提供的大腸桿菌MLST分型方案，選擇7個(gè)管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA，PCR 引 物 序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，包括10μmol／L的上下游引物各2μL，2 mmol／L dNTPs 2．5μL，含 MgCl2的 10×PCR Buffer 5．0μL，5U／μL的La Taq DNA聚合酶0．5 μL，加雙蒸水至49μL，模板DNA 1．0μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃4min；變性94℃30s，退火45s，延伸72℃1min，循環(huán)30次；72℃ 延伸7 min。每次擴(kuò)增均以無DNA模板的體系作為空白對照。取PCR產(chǎn)物3μL以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用相應(yīng)測序引物（表1）進(jìn)行雙向測序。

1．2．5 序列分析 用SeqMan II（DNAStar）軟件并結(jié)合菌株等位基因的正反向序列圖譜對等位基因序列進(jìn)行拼接和校正。將校正后的序列在E．coli MLST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，確定菌株的等位基因型和序列類型。用 MEGA 4．0、eBURST V3軟件分析不同ST型克隆群及菌株之間的親緣關(guān)系。

2 結(jié) 果

2．1 血清型鑒定結(jié)果 29株非O157STEC菌株的血清型鑒定結(jié)果見表2，主要血清型為O103∶H8（8／25）和 O21∶H25（6／29），屬于 O91∶H14、O12∶H21、O45∶H2、O15∶H21血清型的分別有2株菌，有5株菌分別屬于5種不同的血清型，另有2株菌的O血清型未能確定。

表1 fliC，毒力基因和7個(gè)管家基因的PCR引物Tab．1 PCR primers of fliC，virulent genes and seven housekeeping genes

2．2 毒力基因檢測結(jié)果 29株非O157STEC菌株的eaeA基因均為陰性，僅stx1基因陽性的有19株菌（65．52%），僅stx2基因陽性的有4株菌（13．79%），stx1、stx2 基 因 同 時(shí) 陽 性 的 有 6 株 菌（20．69%），菌株的主要毒力基因攜帶情況見表2。

2．3 MLST分型結(jié)果 應(yīng)用7個(gè)管家基因的MLST分型方法，29株非O157STEC可以分成13個(gè)ST型，結(jié)果見表2。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的等位基因型fumC376、recA214和3個(gè)新的序列類型ST2460、ST2467、ST2468。不同ST型別包含的菌株數(shù)有差異，其中ST155包含10株菌（34．48%），為本次研究的優(yōu)勢型別，其次為ST906（17．24%）、ST446（10．34%）、ST33（6．90%），其余9個(gè)序列型均只包含1株菌。

2．4 遺傳進(jìn)化分析 利用MEGA 4．0軟件從堿基組成的角度對13個(gè)ST型別及國外STEC流行的優(yōu)勢 血 清 型 （O157、O26、O103、O111、O145 及O104）菌株的6個(gè)ST型別之間做了系統(tǒng)發(fā)生分析，將7個(gè)管家基因的序列按順序拼接后采用Neighbor－joining法繪制進(jìn)化樹（圖1），Bootstrap值的計(jì)算分析根據(jù)1 000次隨機(jī)抽樣進(jìn)行。結(jié)果顯示，我國非O157STEC菌株除一些ST型別相對特異外，存在與國際上優(yōu)勢血清型親緣關(guān)系較近的ST型菌株。

通過eBURST V3對MLST數(shù)據(jù)庫中所有STEC相關(guān)的ST型進(jìn)行聚類分析，按至少有4個(gè)以上等位基因相似的參數(shù)原則，將不同的ST歸為特定的ST序列群，ST型中單位點(diǎn)差異（SLV）和雙位點(diǎn)差異（DLVs）最多的ST型可作為ST序列群的核心序列 型 （group founder ST）［10］。 結(jié) 果 顯 示 （圖2），ST2460與ST155聚為1個(gè)ST序列群，其他11個(gè)ST型別散在分布。本研究中的3個(gè)型別ST25、ST33、ST446與國外其他ST型聚成3個(gè)ST序列群，且這3個(gè)ST型均為對應(yīng)序列群的核心序列型。

圖1 非O157產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌不同ST型別的遺傳進(jìn)化分析注：斜體加粗字體表示國際上優(yōu)勢血清型STEC的ST型Fig．1 Phylogenetic tree analysis of different STs from 29 non－O157STEC isolatesNote：STs of dominant serotypes of STEC are indicated in bold－face italic type．

3 討 論

目前國際上報(bào)道的非O157STEC菌株的主要血清型 為 O26，O111，O103，O145，O91，O113，O128，O118等［2］。本研究對我國29株非O157STEC的血清分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)以O(shè)103，O21為主，同時(shí)檢測出 O91，O113，O118，O12，O15等血清型的菌株，由此可見，我國部分STEC菌株在血清型分布上與國際流行株既存在相似性，也存在一些差異。這一方面可能與我們分析的菌株數(shù)量有關(guān)，另一方面可能是我們國家菌株本身的特點(diǎn)。我國衛(wèi)生部《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》（ws271－2007）中，對腸出血性大腸桿菌的主要血清型除O157∶H7外，只列舉了O26和O111。根據(jù)本研究結(jié)果，提示在今后的STEC監(jiān)測和檢測工作中，我們也應(yīng)重視其他血清型的菌株。

表2 29株非O157STEC的血清型鑒定、毒力因子檢測及MLST分型結(jié)果Tab．2 Serotypes，virulent gene profiles and sequence types of 29non－O157STEC isolates

圖2 產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌相關(guān)ST型別的eBURST聚類分析注：每個(gè)黑點(diǎn)代表1個(gè)序列型別，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示group founder ST，黃色節(jié)點(diǎn)為subgroup founder ST。紅色圓圈內(nèi)為本研究菌株的13個(gè)ST型別，灰色區(qū)域代表國際上幾個(gè)優(yōu)勢血清型STEC的序列群。Fig．2 Population snapshots of STEC clusters for related STs in the E．coli MLST database by eBURST analysisNote：Black dots represent different STs；blue nodes represent predicted founder STs；yellow nodes represent sub－founders．Thirteen STs identified in this study are circled in red；grey area point to the ST complexes of common serotypes of STEC worldwide．

毒力基因檢測結(jié)果顯示，29株菌的eaeA基因均呈陰性，stx1基因陽性的菌株占了大多數(shù)（86．20%），僅stx2基因陽性菌株只有13．79%，這與王濤等［11］報(bào)道的我國O157STEC分離株的毒力基因特點(diǎn)明顯不同。研究推測，相對于O157∶H7，非O157STEC可能更多地?cái)y帶stx1基因。Hedican等［12］對O157STEC和非O157STEC的毒力基因特點(diǎn)和致病性做了對比分析，與本研究結(jié)果相似。國外相關(guān)研究表明［13］，eaeA陰性的非O157STEC及僅攜帶stx1毒力基因的非O157STEC同樣會導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，如出血性腹瀉、溶血性尿毒綜合癥等。我國非O157STEC菌株eaeA基因依賴以外的粘附機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。

對非O157STEC進(jìn)行分子分型，對了解菌株的遺傳進(jìn)化特征，暴發(fā)溯源等具有重要意義。目前用于病原微生物分子分型主要有基于表型和基因型兩大類?；诨蛐偷腗LST作為一種準(zhǔn)確的分子分型方法，自1998年Maiden［14］等首次運(yùn)用于腦膜炎奈瑟菌的分型以來，以其分辨率高、數(shù)據(jù)可靠、重復(fù)性好、不同實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)便于比較、有利于全球范圍的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于其他病原菌的流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化、致病性等方面的研究。

本研究利用MLST方法對29株非O157 STEC進(jìn)行分子分型研究，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的等位基因型和3個(gè)新的序列型。大多數(shù)型別（12／13）散在分布，推測這些型別之間具有較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系，具有明顯的分子多態(tài)性。Mellmann等［15］通過采用MLST方法，對從德國HUS患者分離的非O157 STEC進(jìn)行分型分析，發(fā)現(xiàn) ST16、ST17、ST21、ST25型別的菌株，O抗原檢測結(jié)果分別為O111、O103、O26、O128，推測這些ST型別及血清型的菌株可能與HUS密切相關(guān)。本次研究中發(fā)現(xiàn)有ST25型別的菌株，雖然我們分析的菌株O血清型和ST型別與他們的結(jié)果存在一定差異，但經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，我們的菌株與國際流行株具有一定的親緣關(guān)系，提示我國應(yīng)同時(shí)加強(qiáng)對這類STEC菌株的檢測和監(jiān)測，掌握菌株的分布和變異規(guī)律，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和甄別暴發(fā)，進(jìn)而對于有效預(yù)防和控制這類疾病在我國的暴發(fā)和流行將具有重要的意義。

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