基因工程抗體親和力成熟研究進展

于禮，梁米芳

·綜述·

基因工程抗體親和力成熟研究進展

于禮，梁米芳

自 1975 年，Kohler 創(chuàng)建雜交瘤技術并成功制備單克隆抗體以來，人們已研制出數以千計的單克隆抗體。單克隆抗體因其高度的靶向特異性已經成為科學研究，疾病診斷，藥物靶向治療等不可或缺的工具。由于雜交瘤技術制備單克隆抗體為鼠源性，在人體應用時易發(fā)生免疫排斥反應，難以有效激發(fā)人體免疫效應，而人源的基因工程抗體很好地解決了這一問題。借助 DNA 重組和蛋白質工程技術，人們可以獲得人源單克隆抗體，并可在基因水平對抗體進行拼接、修飾、重新組裝成為一種新型抗體。目前美國 FDA 已批準22 種單克隆抗體藥物，主要用于腫瘤、病毒和炎癥性疾病的治療，并且現有超過 200 種單克隆抗體正進行臨床試驗。抗體作為藥物蛋白極具市場價值，2007 年抗體產業(yè)市值超過 270 億美元[1]，2010 年市值已超過 480 億美元，已經成為生物治療行業(yè)的新興產業(yè)和重要支柱。自基因工程抗體問世以來，人們發(fā)現某些抗體雖具有良好的結合特異性，但缺乏親和力，尤其由天然噬菌體抗體庫制備的抗體沒有經過抗原誘導的免疫進化，親和力低，極大限制了抗體的臨床應用，因此，抗體體外親和力成熟研究就成為人們關注的熱點，本文對基因工程抗體親和力成熟的研究進展進行綜述。

1 抗體體內親和力成熟

在機體體液免疫系統(tǒng)中，B 淋巴細胞應對抗原刺激誘導抗體產生，并在反復暴露于抗原的過程中，產生高親和力的抗體，這涉及兩個相互關聯的過程：首先在骨髓內編碼抗體輕重鏈的胚系基因片段經 V-(D)-J 隨機重排產生超過106的組合，這是抗體特異性免疫反應的分子基礎；其次，機體接受抗原刺激后，在二級淋巴器官的生發(fā)中心，抗體基因尤其是互補決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）發(fā)生高頻突變，突變導致抗體結合特性改變。經過濾泡樹突狀細胞提呈抗原，只有與抗原親和力最高的 B 細胞將選擇生存進一步分化為漿細胞和記憶細胞。近期研究表明，活化的胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）將胞嘧啶脫氨基轉化為尿嘧啶，突變后的尿嘧啶引發(fā)錯配和堿基剪切并引發(fā) DNA 修復，而不正確修復進一步加劇突變產生，導致抗體基因高頻突變誘發(fā)高親和力抗體產生[2-5]。目前以 AID 誘發(fā)高頻突變?yōu)榛A的哺乳動物細胞展示技術已經成功應用于抗體體外親和力成熟。

2 基因工程抗體體外親和力成熟

抗體體外親和力成熟主要是模擬體內親和力成熟過程，采取各種策略對抗體基因進行相應突變，構建突變抗體庫，通過親和篩選獲得高親和力抗體。在基因工程抗體體外親和力成熟的過程中，選擇突變區(qū)域以及如何引入突變是一個關鍵問題，目前突變策略可分為三大類，隨機突變、置換和定向突變。近期研究中抗體體外親和力成熟的策略仍以隨機突變、置換和熱點區(qū)突變?yōu)橹?，但基于結構實現抗體親和力提升的報道也越來越多。

2.1 易錯 PCR

易錯 PCR 指在采用聚合酶對目的基因擴增時，通過應用錯配率高的聚合酶或調整反應條件等，以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，并通過多輪 PCR 反復進行隨機誘變，累計突變效應，最終獲得目的蛋白的隨機突變體。Groves 等[6]采用易錯 PCR 結合核糖體展示技術，成功將來源于噬菌體抗體庫的抗牛胰島素抗體親和力由 5.8 nmol/L 提升至21 pmol/L。Pavoni 等[7]針對一株腫瘤相關抗原 CEA 單克隆抗體采用易錯 PCR 誘導抗體輕重鏈基因突變，構建噬菌體抗體庫，成功將抗體親和力提升 10倍，達到 nmol/L 水平。Wang 等[8]對 HCV E2 糖蛋白中和抗體 HC-1 采用易錯 PCR 對抗體輕重鏈基因隨機突變，通過酵母文庫使抗體親和力提升 92 倍，其抗病毒中和活性相應提升 30 倍。

2.2 鏈置換

鏈置換通過固定抗體兩條鏈中的一條鏈，對另一條鏈構建具有足夠多樣性的置換文庫，隨機組合有可能產生最佳鏈組合，經過噬菌體抗體庫篩選可獲得高親和力的新抗體。因抗體重鏈在抗結合活性和結構方面的重要性，鏈置換策略常采用輕鏈替換，盡量避免鏈替換后抗體結合特異性發(fā)生變化。Lou 等[9]分別在肉毒桿菌毒素 A、B 型特異性抗體的基礎上，采用酵母展示技術構建輕鏈置換庫，成功將抗體親和力提升 9倍和 77 倍，其親和力提升歸因于抗原抗體復合物解離速率的降低。Hur 等[10]為便于構建鏈置換庫，采用雙質粒系統(tǒng)分別對抗體輕重鏈構建噬菌體文庫，在初篩抗體的基礎上構建人源大容量非免疫輕鏈庫，成功將一株抗IL-15 抗體親和力提升 36 倍。Brockmann 等[11]在合成抗體庫初篩選抗溶菌酶抗體的基礎上，構建庫容為 7 × 108的輕鏈置換庫，將抗體親和力提升近 20 倍，達到 0.8 nmol/L。鏈置換策略的關鍵是置換文庫庫容大小，只有置換鏈基因有足夠的多樣性，才能為抗體提供適宜的、高親和力的配伍鏈。

2.3 CDR 區(qū)定向突變

體細胞高頻突變并非完全隨機，而傾向于發(fā)生在與抗原接觸的互補決定區(qū)，尤其是CDR3 作為抗原結合的核心部位是抗體突變最頻發(fā)的區(qū)段。Steidl 等[12]對一株粒細胞集落刺激因子抗體的重鏈 CDR2 區(qū)和輕鏈 CDR3 區(qū)依次隨機替換，經噬菌體抗體庫篩選獲得親和力成熟抗體，通過合理組合有效突變將抗體親和力提升 5000 倍，達到 7 pmol/L。Lowe 等[13]對 IL-15 細胞因子抗體通過輕重鏈 CDR3 區(qū)定向誘導突變，經過噬菌體抗體庫親和篩選，獲得抗體DISC0280 使親和力提升 228 倍，細胞功能活性提升 4000倍，晶體結構顯示突變后重鏈 CDR3 區(qū) 6 個氨基酸在結合位點形成一個 α 螺旋。Yoon 等[14]對腫瘤相關糖蛋白TAG-72 人源化抗體 AKA 重鏈 CDR3 區(qū)域引入隨機突變，采用噬菌體抗體庫親和篩選，獲得抗體 3E8 的親和力提升 22 倍，并保持原有結合特異性，為腫瘤診斷和治療提供有效手段。進一步研究發(fā)現在編碼可變區(qū)的基因中存在一些位點頻繁突變，而在突變后高親和力抗體中，這些位點數目往往會下降，稱之為熱點（hotspot）[15]。Muller 等[16]對一株前列腺特異抗原的 scFv 抗體采用 CDR 熱點區(qū)突變的方法，對抗體輕鏈 CDR1 和重鏈 CDR1-3 區(qū)域內熱點區(qū)隨機突變，然后通過有效突變合理組合，最終使抗體親和力提升 8.5 倍。

2.4 哺乳動物細胞高頻突變

哺乳動物展示技術受限于庫容，難以產生足夠的多樣性用于篩選目的抗體。Seo 等[17]將哺乳動物細胞展示技術與體外細胞高頻突變相結合，開發(fā)出一種新基因工程抗體制備方法，并成功應用于人源抗體的親和力成熟。在人體內體細胞高頻突變依賴于胞嘧啶核苷脫氨酶，它作用于 B 細胞抗體可變區(qū)的 DNA 序列，介導熱點區(qū)胞嘧啶脫氨反應進而誘發(fā)高頻突變。研究表明高頻突變效應可以通過在體外淋巴細胞和非 B 淋巴細胞中引入重組的 AID 實現，Bower 等[18]在 HEK293T 細胞中同時引入抗體基因和 AID，通過 AID介導的脫氨作用實現抗體基因高頻突變，模擬體內親和力成熟過程，結合流式細胞術分選，成功將一株抗神經細胞生長因子抗體親和力提升至 pmol/L 級。Cumbers 等[19]采用雞B 淋巴細胞系 DT40 在體外培養(yǎng)過程中通過 AID 效應誘導高頻突變，突變累計形成一個抗體庫，通過親和篩選可獲得親和力成熟的抗體。在此基礎上構建 DT40-SW 細胞系優(yōu)化系統(tǒng)，通過引入外源性雌激素衍生物 4-OHT 可選擇性啟動和終止 AID 依賴的突變效應，并通過部分破壞細胞XRCC3 基因的 DNA 損傷修復作用，增強有益于抗體親和力成熟的點突變頻率[20]。Kajita 等[21]采用 DT40-SW 系統(tǒng)成功將一株抗硝基苯胺單克隆抗體的親和力提升 600 倍。哺乳動物細胞體外高頻突變技術的出現克服了哺乳動物展示技術的很多限制，在最大程度上接近體內抗體親和力成熟過程，實現了在全人源、分泌型 IgG 抗體的直接篩選和功能改進，在基因工程抗體研發(fā)中具有極大的應用前景。

2.5 基于三維結構的抗體親和力成熟

隨著結構生物學的發(fā)展，基于結構的藥物設計是目前新藥研發(fā)的熱點領域。但由于蛋白結構和功能的復雜性，基于結構的功能改進一直是人們關注的焦點。隨著大量抗原抗體復合物晶體結構的解析，人們對抗原抗體間相互作用的理解不斷加深，基于結構提升抗體親和力的成功報道也日益增多。從形態(tài)學上來說，當抗體結合不同抗原時，抗體 CDR 結構上也各有特點。當抗原為大分子蛋白時，抗體 CDR 區(qū)呈扁平狀，與抗原接觸區(qū)域較大；與半抗原結合時，抗體 CDR區(qū)呈現特異性較深的凹陷區(qū)；與多肽結合時，抗體 CDR 區(qū)呈特異性凹陷的小溝狀。Clark 等[22]在一株已具有高親和力抗整合素 VLA1 抗體晶體結構的基礎上，從抗體氨基酸骨架微調、側鏈重新裝配、靜電作用優(yōu)化三個方面選擇突變位點，結果從 80 個抗體突變克隆中發(fā)現 10 個突變位點提升抗體親和力，然后通過突變位點組合獲得一株融合 4 個突變位點的抗體，其親和力達到 850 pmol/L。結構顯示突變使抗體骨架發(fā)生微調，增強結構靈活性，與抗原互補性更趨完善，同時突變引入的氫鍵作用也參與提升親和力。

理想狀態(tài)下，高精度的復合物晶體結構能夠直觀顯示抗原抗體間相互作用，從而選擇突變方法和突變位點進行親和力改造。因受限于高精度抗原抗體復合物晶體結構，計算機模擬進行輔助設計成為人們研究的熱點。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法對一株人源抗胃泌素 scFv 抗體 TA4 初步優(yōu)化后，使抗體親和力提升 15 ～ 35 倍，然后通過計算機模擬抗原抗體結合構象，分析結合位點的相互作用以選擇氨基酸定點突變，最終將抗體親和力提升 454倍。結構顯示輕鏈 CDR3 區(qū) 96 位脯氨酸突變在抗體親和力成熟中尤為重要，其突變可能增加抗體 CDR 區(qū)與抗原的結構互補性。

抗原抗體間相互作用為基于三維結構進行抗體親和力改造提供線索，同時，親和力成熟成功案例也加深人們對抗原抗體相互作用的認識。經過親和力成熟的抗體與祖系抗體在三維結構上的差異可以很好地解釋親和力提升的分子機制。Cauerhff 等[24]在解析鼠單克隆抗體 D44.1 及突變體F10.6.6 與溶菌酶復合物三維結構的基礎上，發(fā)現抗體親和力提升并不是通過形成額外的氫鍵和范德華力，也不是抗原抗體結合面積的增加，而是通過抗原結合區(qū)域發(fā)生結構微調，使之在結構互補性方面更適應抗原表位，縮短了抗原抗體相互作用間的距離而增強非極性作用。另外，突變體晶體結構發(fā)現抗原抗體接觸區(qū)域互補性的提升同樣允許水分子位于接觸區(qū)域，而水分子的存在為抗原抗體間的氫鍵搭建了橋梁。近期一項高精度抗原抗體復合物結構表明少量水分子存在于抗原抗體接觸界面，與抗原抗體形成氫鍵。水分子填充了抗原抗體接觸表面的空隙，增強結合能量 1 ～ 2 kcal （1 kcal = 4.1868 kJ）。Zahnd 等[25]報道晶體結構也顯示改進抗體的點突變均未與配體形成直接相互作用，表明抗體骨架結構的微小改變或者側鏈分子間相互作用可提升抗原抗體結合能力。因此，基于晶體結構的分子改進和分子間相互作用分析，兩者相輔相成，互相促進發(fā)展，已成為基因工程抗體親和力成熟的重要手段。

2.6 組合策略

為使抗體親和力成熟達到最好效果，人們可根據抗體特性采用多種突變策略組合，各種基于不同原理的突變策略組合可對基因工程抗體的親和力成熟產生協同增強效應。Luginbühl 等[26]通過對一朊病毒線性多肽抗體采用易錯PCR 和 DNA 重組相結合的突變策略，采用核糖體展示技術成功將親和力提升至 1 pmol/L，晶體結構顯示抗體的輕鏈 Asn39Asp和重鏈 Gly107Ala 突變?yōu)橛H和力提升提供了新的離子鍵和疏水作用。Kobayashi 等[27]在一株針對雌二醇E2 的 scFv-E4 基礎上，先在抗體重鏈 CDR2-3 和輕鏈CDR1-3 區(qū)采用 CDR 重組使抗體親和力提升 5 倍；繼而在抗體輕重鏈區(qū)采用易錯 PCR 使抗體親和力提升近3 倍。Barderas 等[23]采用 CDR 步移法和基于計算機模擬的分子設計對一株人源抗胃泌素 scFv 抗體 TA4 優(yōu)化，使抗體親和力提升 454 倍。

3 抗體庫展示技術

各種突變策略需依賴適當的抗體展示技術才可實現抗體的體外親和力成熟，目前應用成熟的基因工程抗體展示技術包括噬菌體展示、酵母菌展示、核糖體展示以及哺乳動物展示。噬菌體展示技術作為最經典的展示技術，在易錯PCR、置換和定向突變策略中成功使大量基因工程抗體實現了親和力的提升。核糖體展示技術是一種細胞外展示系統(tǒng)，無細胞轉化過程，克服轉染效率和蛋白表達因素的限制，因此容易構建大庫容量的抗體庫（＞ 1012）。酵母展示技術中酵母系統(tǒng)作為真核生物，具有翻譯后修飾所需的細胞器和酶，可正確折疊表達抗體，且蛋白表達水平偏差小，克服了菌體展示技術中蛋白表達及修飾存在偏差的問題。各種抗體庫展示技術各有優(yōu)劣，均可以應用于抗體體外親和力成熟的研究，在實際應用時需根據抗體特性和突變策略選擇不同的展示技術。

4 治療性抗體親和力成熟的應用

治療性抗體藥物因其廣闊的市場前景使得此類藥物研發(fā)和改進成為人們研究的熱點，CDR 區(qū)定點突變、易錯PCR 和基于結構設計等多種策略均成功用于治療性抗體的親和力改進。palivizumab 作為 FDA 批準的呼吸道合胞病毒治療抗體，在少數人群中難以產生保護作用，并難以有效抑制病毒在上呼吸道復制，通過在抗體輕重鏈 6 個 CDR區(qū)定向引入突變，組合有效突變使抗體親和力提升 1000 倍以上，抗病毒中和活性提升 44 倍，但突變抗體產生的非特異性結合也導致其在動物實驗保護活性僅提高 2 倍，在去除導致非特異性結合的氨基酸突變的基礎上獲得的單克隆抗體motavizumab 親和力提升 70 倍，中和活性提升20 倍，在體外動物實驗中抑制病毒活性增強 100 倍[28-29]。Chen 等[30]在基于針對血管內皮生長因子的治療性單克隆抗體bevacizumab 的基礎上，采用 CDR 區(qū)突變策略引入6 個氨基酸突變，開發(fā)出親和力成熟的單克隆抗體藥物ranibizumab，使抗體與血管內皮生長因子的結合活性提升100 倍以上。FDA 批準的治療性抗體cetuximab 通過結合表皮生長因子受體阻斷配體結合發(fā)揮效應，Lippow 等[31]基于計算機輔助設計結合體外定點突變使抗體親和力提升10 倍，達到 52 pmol/L。

5 結語

隨著基因工程抗體親和力成熟研究的不斷深入，人們對抗原抗體相互作用的認識也更加深入。X 射線晶體衍射技術研究抗體親和力成熟的過程提示抗體親和力成熟過程中并沒有抗原抗體結合面積的增加，而可能通過氨基酸調整使得抗原和抗體的結合互補性更趨完善；熱動力學研究認為體外抗體親和力成熟多歸于抗原抗體復合物解離速率的降低[9]，這些認識為抗體親和力成熟策略提供理論支持和選擇依據。抗體作為藥物蛋白已經成為生物行業(yè)的新興產業(yè)和重要支柱，基因工程抗體在基因和蛋白水平上進行功能改進，除提升抗體親和力較關鍵外，抗體的結合特異性、穩(wěn)定性和體內代謝動力學特性也需統(tǒng)籌兼顧，綜合提高抗體在診斷和治療應用中的效能?？傊?，隨著體外抗體親和力成熟突變策略不斷完善，尤其是基于結構的分子設計和哺乳動物細胞展示結合高頻突變技術研究不斷發(fā)展，將更加廣泛地應用并促進抗體產業(yè)的發(fā)展。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.007

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

梁米芳，Email：mifangl@vip.sina.com

2012-04-28