重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白對(duì)不同分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)研究

蒲江 陶立峰 鄧海清 王德海

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2010年，全球約有140萬(wàn)人死于肺結(jié)核，880萬(wàn)罹患結(jié)核病，結(jié)核病已成為當(dāng)今世界第二大傳染性疾病［1－2］。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一，同時(shí)也是全球27個(gè)耐多藥結(jié)核病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一。據(jù)2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)，全國(guó)15歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)［3］，因此早期發(fā)現(xiàn)和診斷出高危人群，有效控制傳染源，是結(jié)核病疫情控制的關(guān)鍵。

近幾年，對(duì)早期分泌性抗原性靶蛋白（ESAT6）和早期培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10）抗原作為結(jié)核診斷的皮試試劑的研究較多，顯示出很好的安全性及較好的診斷特異度和敏感度［4－11］。本研究以重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白作為抗原，對(duì)不同分枝桿菌菌種致敏的豚鼠進(jìn)行皮試反應(yīng)研究。

材料和方法

一、材料

1.動(dòng)物：選取90只健康并未做過(guò)任何試驗(yàn)的SPF級(jí)（無(wú)特定病原體級(jí)）白色雌性豚鼠（Hartley品系），體質(zhì)量300～400 g（一般體質(zhì)量滿足即可采用），周齡為15～20周。由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2009－0017。

2.菌種：常見(jiàn)環(huán)境分枝桿菌組包括鳥(niǎo)分枝桿菌（CMCCB 95001）、胞內(nèi)分枝桿菌（CMCCB 95002）、蟾蜍分枝桿菌（CMCCB 95003）、堪薩斯分枝桿菌（CMCCB 95013）、海分枝桿菌（CMCCB 95014）、瘰癘分枝桿菌（CMCCB 95017）、戈登分枝桿菌（CMCCB 95018）、蘇加分枝桿菌（CMCCB 95019）、龜分枝桿菌膿腫亞種（CMCCB 95021）（簡(jiǎn)稱“龜膿分枝桿菌”）、偶發(fā)分枝桿菌（CMCCB 95022）、草分枝桿菌（CMCCB 95024）、微黃分枝桿菌（CMCCB 95030）；臨床常見(jiàn)致病分枝桿菌組包括非洲分枝桿菌（CMCCB 95049）、牛分枝桿菌（CMCCB 95055）、結(jié)核分枝桿菌（CMCCB 95052，CMCCB 93020，CMCCB 93009）；菌株由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供?？ń榫ㄒ呙缰辏┯芍袊?guó)食品藥品檢定研究院提供。

3.主要試劑：結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin，TB－PPD），50 IU/ml，批號(hào)為20101105，液體制劑，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；胞內(nèi)分枝桿菌純蛋白衍生物（PPD of Mycobacterium intracellulare，PPD－B），0.4 mg/支，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白，每支250μg/0.5 ml，液體制劑，批號(hào)為 M20101202，由安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司提供。

二、方法

1.菌液制備：取卡介菌凍干菌種（60 mg/支），以1 ml生理鹽水溶解后制成濃度為60 mg/ml的菌液。將其余15種新鮮培養(yǎng)的分枝桿菌配制成10 mg/ml菌液（活菌含量約為1×108CFU/ml），臨用前再以生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋。

2.動(dòng)物篩選（皮試）：將豚鼠左背側(cè)局部去毛，皮內(nèi)注射0.2 ml TB－PPD，于注射后24、48 h觀察局部硬結(jié)的縱徑與橫徑，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，平均硬結(jié)反應(yīng)直徑（縱徑與橫徑相加除以2）小于5 mm判為陰性［12］。90只豚鼠全部皮試陰性，留做實(shí)驗(yàn)。共分為18組實(shí)驗(yàn)，每組使用5只豚鼠。

3.致敏動(dòng)物：于豚鼠腹股溝皮下注射制備的菌液［13］，每種菌液致敏5只豚鼠（皮試48 h后，如果皮試陰性，即可開(kāi)始致敏）?？ń榫ㄒ呙缰辏┗罹旅艚M豚鼠和結(jié)核分枝桿菌死菌致敏組豚鼠各注射0.2 ml/只，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房；其他分枝桿菌活菌菌液致敏組豚鼠注射0.5 ml/只，飼養(yǎng)于負(fù)壓動(dòng)物房的負(fù)壓動(dòng)物籠具中。

4.重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白的制備：采用基因工程手段構(gòu)建ESAT6－CFP10融合蛋白表達(dá)載體，篩選陽(yáng)性菌落并測(cè)序正確，建立生產(chǎn)用種子批系統(tǒng)［14］。將工作種子通過(guò)復(fù)蘇、傳代后發(fā)酵，最終通過(guò)純化獲得重組結(jié)核桿菌ESAT6－CFP10目的蛋白。

5.致敏動(dòng)物皮試：在致敏動(dòng)物3～4周后，將豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，以輪圈法［15］分別于豚鼠皮內(nèi)注射1μg/ml和5μg/ml的ESAT6－CFP10蛋白、1μg/ml和5μg/ml的PPD－B、TB－PPD（50 IU/ml）各0.1 ml。于注射后24、48 h觀察局部硬結(jié)的縱徑與橫徑，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，平均硬結(jié)反應(yīng)直徑≥5 mm判為陽(yáng)性［16］。

結(jié) 果

一、臨床常見(jiàn)致病分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)結(jié)果

皮試反應(yīng)顯示，TB－PPD、ESAT6－CFP10蛋白以及PPD－B對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、卡介菌（疫苗株）和非洲分枝桿菌活菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陽(yáng)性，而ESAT6－CFP10蛋白對(duì)卡介菌（疫苗株）、結(jié)核分枝桿菌死菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)呈陰性（圖1）。硬結(jié)直徑統(tǒng)計(jì)及陽(yáng)性比例見(jiàn)表1。

二、常見(jiàn)環(huán)境分枝桿菌組致敏豚鼠的皮試反應(yīng)結(jié)果

PPD－B對(duì)鳥(niǎo)、胞內(nèi)、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發(fā)、草、微黃分枝桿菌這12種常見(jiàn)環(huán)境分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陽(yáng)性，而ESAT6－CFP10蛋白以及TB－PPD對(duì)上述分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陰性，48 h的皮試硬結(jié)直徑與陽(yáng)性比例結(jié)果見(jiàn)表2。

討 論

圖1 致敏豚鼠皮試硬結(jié)狀況

表1 臨床常見(jiàn)致病分枝桿菌組致敏豚鼠致敏后48 h的皮試平均硬結(jié)直徑及陽(yáng)性比例

表2 常見(jiàn)環(huán)境分枝桿菌致敏組豚鼠48 h皮試平均硬結(jié)直徑及陽(yáng)性比例

多年來(lái)，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin testing，TST）一直是篩選結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和結(jié)核病輔助診斷的重要方法。但TST所用PPD所包含的抗原為常見(jiàn)致病性分枝桿菌（結(jié)核、牛和非洲分枝桿菌）、環(huán)境中的分枝桿菌（鳥(niǎo)、胞內(nèi)、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發(fā)、草、微黃等分枝桿菌）及BCG所共有，診斷特異度較差，不能區(qū)分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染，更不能鑒別結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)有無(wú)存活的結(jié)核分枝桿菌；而卡介苗在世界范圍內(nèi)廣泛接種會(huì)干擾TST的檢測(cè)，減少其診斷效果。對(duì)于某些嚴(yán)重結(jié)核病、血行散播性肺結(jié)核或HIV感染者等免疫力低下者，TST診斷的敏感度也不理想。因此，尋找既能區(qū)別卡介苗接種還是結(jié)核分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)有無(wú)活菌又敏感度高的診斷方法非常重要。

Maheiras等［17］確定了結(jié)核分枝桿菌基因的差別區(qū)（regions of difference，RD），其中最為重要的RD1區(qū)基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌有毒株所特有，而B(niǎo)CG和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌缺失。ESAT6是RD1區(qū)發(fā)現(xiàn)較早的重要分泌型蛋白，由Rv3875基因編碼，全長(zhǎng)285個(gè)堿基對(duì)，編碼95個(gè)氨基酸。1998年Berthet等［18］在研究ESAT6基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)了Lhp基因。Lhp基因即Rv3874基因，位于ESAT6基因上游34 bp處，和ESAT6基因處于同一操縱單元。此基因編碼100個(gè)氨基酸，又由于其基因產(chǎn)物在早期培養(yǎng)濾液中出現(xiàn)，因此命名為培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10）。ESAT6基因和CFP10基因處于同一操縱子中，一起進(jìn)行協(xié)同轉(zhuǎn)錄?；虍a(chǎn)物均為分泌性蛋白，存在于結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)濾液中。

ESAT6蛋白和CFP10蛋白作為結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原，兩者具有大致相同的菌間分布特性。根據(jù)Swissprot和Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)資料分析，ESAT6基因和CFP10基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和4種非典型分枝桿菌（堪薩斯、海、微黃和蘇加分枝桿菌）中，BCG和大部分非結(jié)核分枝桿菌缺失［16，19－20］。雖然研究?jī)苫蚓g分布特性所用到的菌株不完全相同，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以說(shuō)明CFP10和ESAT6基因具有大致相同的菌間分布，即兩基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，BCG和大部分的非結(jié)核分枝桿菌缺失。

目前國(guó)內(nèi)外研究較多的是將CFP10和ESAT6蛋白作為刺激原，應(yīng)用體外酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）技術(shù)診斷結(jié)核病。Ravn等［21］的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示：在39名無(wú)結(jié)核分枝桿菌暴露史的BCG接種健康人中，PPD－ELISA 的陽(yáng)性率為100%，而CFP10－ESAT6－ELISA 陽(yáng)性僅有1例，具有良好的診斷特異度。對(duì)痰菌陰性結(jié)核患者用ESAT6和CFP10抗原進(jìn)行體外診斷，87%的患者能夠被發(fā)現(xiàn)，敏感度較好。

近幾年，以ESAT6為抗原作為結(jié)核診斷的皮試試劑研究也較多。國(guó)內(nèi)張靈霞等［4］報(bào)道將ESAT6作為皮膚反應(yīng)試劑用于結(jié)核病診斷，發(fā)現(xiàn)ESAT6皮試可以很好地區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和BCG致敏的動(dòng)物。國(guó)內(nèi)徐苗等［5］對(duì)ESAT6基因進(jìn)行改構(gòu)得到重組11 k Da蛋白，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，重組結(jié)核分枝桿菌11 k Da蛋白對(duì)結(jié)核分枝桿菌活菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗(yàn)為陽(yáng)性，而對(duì)滅活結(jié)核分枝桿菌、卡介菌和其他非結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗(yàn)均為陰性。Aggerbeck等［6］研究發(fā)現(xiàn)重組ESAT6蛋白在豚鼠、小鼠和狗等動(dòng)物上均有較好的安全性，皮試濃度從1μg到1000μg僅有個(gè)別輕微不良反應(yīng)出現(xiàn)。目前，ESAT6蛋白作為皮試試劑已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床，國(guó)外Arend等［7］隨機(jī)雙盲臨床實(shí)驗(yàn)顯示，ESAT6有很好的臨床安全性和生物活性。國(guó)內(nèi) Wu等［8］報(bào)道在小部分志愿者中進(jìn)行ESAT－6蛋白皮試，結(jié)果顯示ESAT－6蛋白僅誘導(dǎo)結(jié)核患者陽(yáng)性反應(yīng)，BCG接種健康者為陰性反應(yīng)。

目前以CFP－10蛋白作為皮試試劑，僅在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，尚無(wú)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。國(guó)外Van Pinxteren等［9］研究發(fā)現(xiàn)CFP10和ESAT6兩種蛋白，均能很好的誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠的皮試呈陽(yáng)性反應(yīng)。而在BCG和鳥(niǎo)分枝桿菌致敏豚鼠中，兩種蛋白皮試結(jié)果陰性或僅有個(gè)別陽(yáng)性，敏感度和特異度均好于PPD，但CFP10蛋白的特異度低于ESAT6蛋白。同時(shí)IFN－γ體外刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示兩種蛋白聯(lián)用的敏感度和特異度均高于單一蛋白［9］。Weldingh等［10］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示兩種蛋白聯(lián)用的敏感度與PPD相近，較單一抗原敏感度高。

本研究利用基因工程技術(shù)融合表達(dá)CFP10－ESAT6蛋白，該蛋白僅對(duì)活結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌致敏動(dòng)物呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)卡介菌接種或死結(jié)核分枝桿菌及常見(jiàn)環(huán)境分枝桿菌致敏動(dòng)物均呈陰性反應(yīng)，提示CFP10－ESAT6蛋白如果作為皮試試劑能夠鑒別BCG接種和結(jié)核分枝桿菌感染，可為結(jié)核病的輔助診斷提供強(qiáng)有力的支持。如能應(yīng)用于臨床，將對(duì)結(jié)核病的診斷及傳播控制有著非常重要的意義。但是由于本研究實(shí)驗(yàn)組數(shù)較多，工作量比較大，再加上課題時(shí)間的限制，每組實(shí)驗(yàn)只采用了5只豚鼠，統(tǒng)計(jì)學(xué)上可能存在一定的誤差，這也是今后進(jìn)一步深入研究所需要改進(jìn)之處。

由于中國(guó)屬于結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，可為臨床研究規(guī)模和內(nèi)容提供良好空間，如果上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)能在人體得到驗(yàn)證，該結(jié)果將為臨床上結(jié)核病的早期診斷和鑒別診斷提供重要的依據(jù)，為結(jié)核病的控制節(jié)省大量的資源。

［1］ World Health Organization.WHO warns of consequences of underfunding TB.2011［2011－10－11］.http：//www.who.int/mediacentre/news/releases/2011/tb＿20111011/en/index.html.

［2］World Health Organization.Global tuberculosis control 2011.Geneva：WHO，2011.

［3］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485－508.

［4］張靈霞，吳雪瓊，史迎昌，等.幾種結(jié)核分支桿菌重組蛋白誘發(fā)豚鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的研究.中國(guó)防癆雜志，2002，24（3）：116－118.

［5］徐苗，羅永艾，黎有倫，等.重組結(jié)核分枝桿菌11000蛋白對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的鑒別作用.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（11）：762－765.

［6］Aggerbeck H，Madsen SM.Safety of ESAT 6.Tuberculosis（Edinb），2006，86（5）：363－373.

［7］Arend SM，F(xiàn)ranken WP，Aggerbeck H，et al.Double－blind randomized Phase I study comparing rd ESAT－6 to tuberculin as skin test reagent in the diagnosis of tuberculosis infection.Tuberculosis（Edinb），2008，88（3）：249－261.

［8］Wu X，Zhang L，Zhang J，et al.Recombinant early secreted antigen target 6 protein as a skin test antigen for the specific detection of Mycobacterium tuberculosis infection.Clin Exp Immunol，2008，152（1）：81－87.

［9］Van Pinxteren LA，Ravn P，Agger EM，et al.Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT－6 and CFP－10.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（2）：155－160.

［10］Weldingh K，Andersen P.ESAT－6/CFP10 skin test predicts disease in M.tuberculosis－infected guinea pigs.PLoS One，2008，3（4）：e1978.

［11］Huber CA，Ruf MT，Pluschke G，et al.Independent loss of immunogenic proteins in Mycobacterium ulcerans suggests immune evasion.Clin Vaccine Immunol，2008，15（4）：598－606.

［12］衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局，衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008版）.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009.

［13］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典三部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［14］Sambrook J，Russell DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.3版.黃培堂，主譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

［15］中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品規(guī)程.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［16］Dillon DC，Alderson MR，Day CH，et al.Molecular and immunological characterization of Mycobacterium tuberculosis CFP－10，an immunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bovis BCG.Clin Microbiol，2000，38（9）：3285－3290.

［17］Maheiras GG，Sabo PJ，Hickey MJ，et al.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M.bovis.Bacteriol，1996，178（5）：1274－1282.

［18］Berthet FX，Rasmussen PB，Rosenkrands I，et al.A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT－6 and a novel lowmolecular－mass culture filtrate protein（CFP－10）.Microbiology，1998，144（Pt11）：3195－3203.

［19］Sorensen AL，Nagai S，Houen G，et al.Purification and characterization of a low molecular－mass T－cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1995，63（5）：1710－1717.

［20］Harboe M，Oettinger T，Wiker HG，et al.Evidence for occurrence of the ESAT－6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virolent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG.Infect Immun，1996，64（1）：16－22.

［21］Ravn P，Munk ME，Andersen AB，et al.Prospective evaluation of a whole－blood test using Mycobacterium tuberculosis－specific antigens ESAT－6 and CFP－10 for diagnosis of tuberculosis.Clin Diag Lab Immunol，2005，12（4）：491－496.