結(jié)核病新疫苗的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法研究

都偉欣 董娜 陳保文 徐苗 楊蕾 盧錦標(biāo) 沈小兵 王國(guó)治

隨著疫苗臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)報(bào)道越來(lái)越多，疫苗研發(fā)過(guò)程中的安全性評(píng)價(jià)日益引起人們的重視。由于疫苗的作用機(jī)理是引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，故疫苗接種后的多數(shù)不良反應(yīng)是由免疫系統(tǒng)引起的毒性反應(yīng)［1］。為了保證疫苗在人體應(yīng)用的安全性，我國(guó)從2002年開始要求新型疫苗作臨床前的免疫毒性分析。

疫苗的免疫毒性主要包括：免疫抑制、超敏反應(yīng)和自身免疫三大類。但其中超敏反應(yīng)最為常見，而超敏反應(yīng)中又以Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)最為常見與兇險(xiǎn)。Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)多為全身性反應(yīng)，目前對(duì)其評(píng)價(jià)大多依靠全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型仍多為大鼠和小鼠。但這些方法均主觀性較強(qiáng)，并且難以量化。而豚鼠是公認(rèn)的對(duì)致敏物質(zhì)比較敏感的動(dòng)物，并且與人類Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病狀態(tài)較為接近［2－3］。本研究以豚鼠為過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型，初步建立了評(píng)價(jià)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的幾種量化檢測(cè)指標(biāo)和方法，并將建立的方法初步應(yīng)用到結(jié)核病新疫苗（恥垢疫苗）的免疫毒性評(píng)價(jià)中。

材料和方法

一、材料

1.試劑和耗材：雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）和 Al（OH）3（0.5 mg/ml）由北京生物制品研究所惠贈(zèng)。羊抗豚鼠IgG1抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體購(gòu)于Ab D Serotec公司。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液購(gòu)于Amresco公司。豚鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)笊?。Hank液、刀豆球蛋白A（concanavalin A，Con A）、臺(tái)氏液、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物有限公司。15及50 ml離心管、96和24孔酶標(biāo)板（Corning公司）均購(gòu)于希爾誠(chéng)公司。組胺檢測(cè)試劑盒（histamine enzyme immunoassay kit）和白三烯檢測(cè)試劑盒（leukotriene C4 EIA kit）購(gòu)于Cayman公司。其他試劑和耗材均為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2.儀器：酶標(biāo)儀：Labsystems Dragon公司；離心機(jī)：Eppendorf公司。

3.豚鼠：品系：Hartley，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、方法

（一）豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)模型的制備

首先制備免疫原［含0.05 mg/ml Al（OH）3和1 mg/ml OVA］，方法是取120 mg OVA溶于48 ml生理鹽水中，另取12 ml Al（OH）3與60 ml生理鹽水充分混勻后，邊振蕩邊加入已溶解的OVA，4℃振蕩過(guò)夜即可。然后將體質(zhì)量300～350 g的雄性豚鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為過(guò)敏模型組和生理鹽水對(duì)照組（簡(jiǎn)稱對(duì)照組），其中過(guò)敏模型組30只，對(duì)照組15只。最后免疫豚鼠，取1 ml免疫原，過(guò)敏模型組中每只豚鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫。此后每2周加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫時(shí)取1 ml同樣免疫原對(duì)每只豚鼠進(jìn)行肌內(nèi)注射，共加強(qiáng)免疫3次。對(duì)照組以生理鹽水代替免疫原對(duì)豚鼠進(jìn)行注射，注射方式同過(guò)敏模型組。

（二）豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立

將過(guò)敏模型組和對(duì)照組豚鼠在末次免疫后7 d進(jìn)行心臟取血并分離血清，應(yīng)用棋盤滴定法建立豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)步驟為：分別以1、2、4、6、8、10μg/ml濃度的羊抗豚鼠IgG1抗體包被酶標(biāo)板。包被結(jié)束并洗板后，每孔加入200μl封閉液在室溫下進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束并洗板后，分別加入1∶103、1∶104和1∶105稀釋的豚鼠血清，同時(shí)做空白對(duì)照和試劑對(duì)照，每孔100μl，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束并洗板后，每孔加入200μl 1∶20 000和1∶50 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束并洗板后，每孔加入200μl TMB底物顯色液，避光孵育5 min。每孔加入50μl的2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀上讀取每孔A450值。數(shù)據(jù)處理：分別計(jì)算陽(yáng)性孔與陰性對(duì)照孔的比值（P/N），按照P/N值＞2.1為陽(yáng)性。

（三）豚鼠不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）含量檢測(cè)方法的建立

1.外周血嗜堿粒細(xì)胞的分離和體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì)方法的建立：首先從過(guò)敏模型組和對(duì)照組豚鼠中按照數(shù)字表法分別隨機(jī)選擇10只和5只進(jìn)行心臟取血，每只取血約4 ml，取血后迅速注入抗凝管中，顛倒混勻。然后應(yīng)用豚鼠淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。裂解結(jié)束后，用1 ml Hank液進(jìn)行重懸。重懸后顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml。將調(diào)好濃度的各管細(xì)胞懸液于37℃孵育10 min后充分振蕩彈勻。每管取細(xì)胞懸液300μl，加入等量的 OVA（1 mg/ml）液進(jìn)行體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì)；同時(shí)每管取細(xì)胞懸液300μl，加入等量的 Con A（10μg/ml）液作陽(yáng)性對(duì)照；每管另取細(xì)胞懸液300μl，加入等量生理鹽水作陰性對(duì)照。將所有管置37℃水浴45 min進(jìn)行刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，所有管均離心，離心條件：25℃，720×g離心10 min，離心結(jié)束后取上清液即可。

2.支氣管肺泡灌洗液收集方法的建立：按照數(shù)字表法隨機(jī)選擇過(guò)敏模型組10只和對(duì)照組豚鼠5只，在末次免疫后7 d，從后肢靜脈注射1 mg/ml OVA溶液予以激發(fā)。激發(fā)后麻醉豚鼠，進(jìn)行支氣管插管術(shù)取支氣管肺泡灌洗液。方法是用注射器緩慢注入37℃預(yù)熱的無(wú)菌生理鹽水2.5 ml，保留30 s后抽出，重復(fù)進(jìn)行4次，收集全部支氣管肺泡灌洗液，總計(jì)約10 ml。將收集的支氣管肺泡灌洗液液置無(wú)菌15 ml離心管中進(jìn)行離心，離心條件：4℃，444×g離心10 min，離心結(jié)束后取上清液即可。

3.腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞的分離和體外刺激分泌過(guò)敏性介質(zhì)方法的建立：按照數(shù)字表法隨機(jī)選擇過(guò)敏模型組10只和對(duì)照組豚鼠5只，末次免疫結(jié)束后斷頸處死，用20 ml臺(tái)氏液（含肝素鈉5 IU/ml）對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射吸取腹腔灌洗液。將腹腔灌洗液置于50 ml無(wú)菌離心管中進(jìn)行離心，離心條件：4℃，720×g離心15 min，離心結(jié)束后棄上清收集細(xì)胞沉淀。加入1 ml紅細(xì)胞裂解液于細(xì)胞沉淀中，4℃，444×g離心5 min，離心結(jié)束后棄上清。用臺(tái)氏液重懸細(xì)胞沉淀并洗滌細(xì)胞2次后，用1 ml臺(tái)式液重懸細(xì)胞進(jìn)行鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度至2×106/ml。取24孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1 ml的OVA液（1 mg/ml）、0.9 ml臺(tái)氏液和1 ml細(xì)胞懸液體外刺激肥大細(xì)胞分泌過(guò)敏性介質(zhì)。陰性對(duì)照為每孔加入0.1 ml無(wú)菌生理鹽水、0.9 ml臺(tái)氏液和1 ml細(xì)胞懸液。加樣完畢后，將培養(yǎng)板置37℃孵箱中刺激培養(yǎng)30 min。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行離心，離心條件：4℃，405×g離心15 min，離心結(jié)束后取上清液即可。

4.ELISA法檢測(cè)各樣本中過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）的含量：（1）組胺含量的檢測(cè)：應(yīng)用Histamine Enzyme Immunoassay試劑盒對(duì)上述“1～3”段中的各樣本組胺含量進(jìn)行檢測(cè)。不同來(lái)源樣本處理方式有差異，其中外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本用Hank液做4倍稀釋；支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用酶免疫試驗(yàn)（EIA）緩沖液做5倍稀釋；腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本用臺(tái)氏液做4倍稀釋。不同樣本檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品制備所用的稀釋液與待測(cè)樣本的稀釋液相一致，即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺(tái)氏液稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。（2）白三烯含量的檢測(cè)：應(yīng)用Leukotriene C4 EIA試劑盒對(duì)上述“1～3”段中的各樣本組白三烯含量進(jìn)行檢測(cè)。不同來(lái)源樣本處理方式有差異，其中外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本直接檢測(cè)；支氣管肺泡灌洗液的上清液樣本用EIA緩沖液做2倍稀釋后檢測(cè)。不同樣本檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)品制備所用的稀釋液與待測(cè)樣本的所含溶液或稀釋液相一致，即分別以Hank液、EIA緩沖液和臺(tái)氏液稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)步驟完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

（四）應(yīng)用以上建立的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)核病新疫苗（恥垢疫苗）的免疫毒性

1.動(dòng)物分組和免疫：Hartley豚鼠，雄性，體質(zhì)量300～350 g，將豚鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，分別為恥垢疫苗組、過(guò)敏模型陽(yáng)性組和生理鹽水陰性對(duì)照組，每組12只。恥垢疫苗組：以濃度35μg/ml的恥垢疫苗原液后腿肌內(nèi)注射豚鼠，每只0.5 ml，每2周加強(qiáng)免疫1次，共免疫4次。過(guò)敏模型陽(yáng)性組和生理鹽水陰性對(duì)照組免疫方式同豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)模型的制備。

2.血清中總IgG1抗體水平檢測(cè)：以上各組豚鼠中按照數(shù)字表法隨機(jī)選取8只，心臟采血后分離血清。應(yīng)用“豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立”中已建立的ELISA方法檢測(cè)豚鼠血清中總IgG1抗體水平。其中羊抗豚鼠IgG1抗體包被濃度為6μg/ml，豚鼠血清稀釋度為1∶105，HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋度為1∶20 000。具體實(shí)驗(yàn)步驟同上面“豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立”段所述。

3.不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè)：（1）不同組織來(lái)源樣本的制備：以上各組豚鼠中按照數(shù)字表法隨機(jī)選取6只，心臟取血分離外周血嗜堿粒細(xì)胞，然后進(jìn)行支氣管插管術(shù)取支氣管肺泡灌洗液。各組再按照數(shù)字表法隨機(jī)選取另外6只，經(jīng)注射器取腹腔灌洗液中分離的肥大細(xì)胞。制備過(guò)程同上面“豚鼠不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）含量檢測(cè)方法的建立”段所述。（2）組胺含量的檢測(cè)：外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本中組胺含量檢測(cè)同上面“組胺含量的檢測(cè)”段所述。（3）白三烯含量的檢測(cè)：外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本、支氣管肺泡灌洗液樣本和腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液樣本中白三烯含量檢測(cè)同上面“白三烯含量的檢測(cè)”段所述。

結(jié) 果

一、豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)方法的建立結(jié)果

總IgG1抗體棋盤滴定結(jié)果：確定6μg/ml羊抗豚鼠IgG1抗體包被，待測(cè)血清稀釋1∶105，以及HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG1抗體稀釋1∶20 000的條件為最佳實(shí)驗(yàn)條件，以此為條件建立豚鼠血清中總IgG1抗體檢測(cè)方法。

二、豚鼠過(guò)敏模型中不同組織來(lái)源的過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）含量檢測(cè)結(jié)果

（一）組胺含量檢測(cè)結(jié)果

1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中的組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中組胺含量為（99.37±15.34）nmol/L，而對(duì)照組中組胺含量為（29.94±5.86）nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝12.60，P＜0.05）。見圖1。

圖1 過(guò)敏模型組和對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液組胺含量的檢測(cè)結(jié)果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中組胺含量為（73.42±18.60）nmol/L，而對(duì)照組中組胺含量為（31.00±12.09）nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.41，P＜0.05）。見圖1。

3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中組胺含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中組胺含量為（39.59±12.94）nmol/L，而對(duì)照組中組胺含量為（14.35±5.85）nmol/L。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.20，P＜0.05）。見圖1。

（二）白三烯含量檢測(cè)結(jié)果

1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中的白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中白三烯含量為（13.09±3.87）pg/ml，而對(duì)照組中白三烯含量為（2.22±0.53）pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中白三烯含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.46，P＜0.05）。見圖2。

圖2 過(guò)敏模型組和對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液白三烯含量的檢測(cè)結(jié)果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中白三烯含量為（123.20±16.57）pg/ml，而對(duì)照組中白三烯含量為（39.05±16.94）pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中組胺含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝9.15，P＜0.05）。見圖2。

3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：ELISA法檢測(cè)模型組和對(duì)照組腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中白三烯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過(guò)敏模型組中白三烯含量為（6.79±2.58）pg/ml，而對(duì)照組中白三烯含量為（3.09±1.18）pg/ml。兩樣本經(jīng)t檢驗(yàn)，過(guò)敏模型組中白三烯含量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.85，P＜0.05）。見圖2。

三、結(jié)核病新疫苗（恥垢疫苗）評(píng)價(jià)中豚鼠血清總IgG1抗體檢測(cè)結(jié)果

ELISA法分別對(duì)生理鹽水陰性對(duì)照組、過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組和恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組豚鼠血清中總IgG1抗體A值為0.179±0.03，與生理鹽水陰性對(duì)照組（A 值為0.156±0.05）相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組總IgG1水平（A值為1.768±0.13）。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝33.68，P＜0.01），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－1.06，P＞0.05）。見圖3。

圖3 恥垢疫苗與對(duì)照組總IgG1抗體水平檢測(cè)結(jié)果

四、結(jié)核病新疫苗（恥垢疫苗）評(píng)價(jià)中豚鼠過(guò)敏性介質(zhì)（組胺和白三烯）含量檢測(cè)結(jié)果

（一）組胺含量檢測(cè)結(jié)果

1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（61.64±21.62）nmol/L］，與生理鹽水陰性對(duì)照組［（59.22±16.55）nmol/L］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量（128.3±61.5 nmol/L）。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.50，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－0.22，P＞0.05）。見圖4。

圖4 恥垢疫苗與對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液組胺含量的檢測(cè)結(jié)果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（53.2±25.5）nmol/L ］與生理鹽水陰性對(duì)照組［（42.58±16.1）nmol/L］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量［（119.5±60.8）nmol/L］。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－2.46，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.87，P＞0.05）。見圖4。

3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中組胺含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（24.52±6.69）nmol/L］與生理鹽水陰性對(duì)照組［（23.08±5.56）nmol/L］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的組胺含量［（44.92±14.19）nmol/L］。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－3.19，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.41，P＞0.05）。見圖4。

（二）白三烯含量檢測(cè)

1.外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清液中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（9.89±6.36）pg/ml］與生理鹽水陰性對(duì)照組［（6.91±1.92）pg/ml］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量［（19.98±6.74）pg/ml］。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－2.67，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t＝1.10，P＞0.05）。見圖5。

圖5 恥垢疫苗與對(duì)照組中不同組織來(lái)源的樣本上清液白三烯含量的檢測(cè)結(jié)果

2.支氣管肺泡灌洗液上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清液中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（28.94±21.55）pg/ml］與生理鹽水陰性對(duì)照組［（25.39±20.14）pg/ml］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量［（79.8±36.3）pg/ml］。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－2.95，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.29，P＞0.05）。見圖5。

3.腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量檢測(cè)結(jié)果：對(duì)各組豚鼠腹腔肥大細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)上清中白三烯含量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：恥垢疫苗組組胺含量［（6.64±3.73）pg/ml］與生理鹽水陰性對(duì)照組［（2.73±0.68）pg/ml］相近，低于過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組的白三烯含量［（11.26±2.52）pg/ml］。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，恥垢疫苗組與過(guò)敏模型陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.52，P＜0.05），與生理鹽水陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－2.53，P＞0.05）。見圖5。

討 論

結(jié)核病新疫苗的研究一直是結(jié)核病研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，各類型的新疫苗研究進(jìn)展很快。疫苗最終將應(yīng)用于人體，其是否具有很好的安全性是疫苗審評(píng)部門和研發(fā)部門非常關(guān)注的問(wèn)題。通常疫苗的不安全性因素是接種后引發(fā)不良反應(yīng)。臨床統(tǒng)計(jì)資料顯示疫苗引起的不良反應(yīng)中以過(guò)敏反應(yīng)所占比例最大。其中，Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率較高，且最為嚴(yán)重。因此，建立Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物模型和可量化的各種免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，并以此來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)核病新疫苗或其他新疫苗的臨床前安全性將具有很重要的意義。

國(guó)外的免疫毒理學(xué)研究中多以大鼠和小鼠作為Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)動(dòng)物模型，但評(píng)價(jià)方法缺乏可以量化的指標(biāo)，具有一定的主觀性。豚鼠作為Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)最為敏感的動(dòng)物，其過(guò)敏反應(yīng)可表現(xiàn)出與人類哮喘相似的病理生理學(xué)癥狀，并且豚鼠對(duì)分枝桿菌及其相關(guān)產(chǎn)品具有高度敏感性。因此，筆者選擇豚鼠作為疫苗特別是結(jié)核病疫苗免疫毒性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。同時(shí)建立幾種量化的檢測(cè)指標(biāo)和方法進(jìn)行疫苗的免疫毒性評(píng)價(jià)。

過(guò)敏抗體的產(chǎn)生可以使疫苗引起毒性反應(yīng)，其中IgE作為過(guò)敏反應(yīng)的主要抗體研究已較為深入和明確。然而，Ig E并不是檢測(cè)豚鼠過(guò)敏抗體的惟一指標(biāo)。近年來(lái)，IgG及其亞型在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中的作用愈來(lái)愈受到重視［4－5］。有研究表明，IgG抗體，特別是IgG1抗體同樣參與了豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，甚至有可能是主要過(guò)敏抗體［6－7］。并且相比于IgE引起過(guò)敏反應(yīng)作用較為緩慢，IgG抗體在Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)中發(fā)生作用更加迅速、短暫。根據(jù)豚鼠IgG抗體在過(guò)敏反應(yīng)中的這一特點(diǎn)，筆者選擇血清中IgG1抗體的水平作為疫苗Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)毒理學(xué)評(píng)價(jià)的血清學(xué)指標(biāo)，通過(guò)ELISA棋盤滴定實(shí)驗(yàn)建立了總IgG1抗體的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)敏模型組中的總IgG1抗體水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)IgG1抗體參與了豚鼠過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。

組胺和白三烯均是過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的重要因子和炎性介質(zhì)，其濃度高低可以定量反映Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度［8－9］。實(shí)驗(yàn)研究中，筆者建立了激發(fā)后豚鼠支氣管肺泡灌洗液上清的收集方法、未激發(fā)豚鼠外周血嗜堿粒細(xì)胞的分離和體外刺激培養(yǎng)方法，以及腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞分離和體外刺激培養(yǎng)的方法，并對(duì)各上清中的組胺和白三烯含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，過(guò)敏模型組豚鼠各樣本上清中的組胺和白三烯含量均顯著高于對(duì)照組。這表明通過(guò)檢測(cè)這3種樣本中組胺和白三烯的含量，將可能成為評(píng)價(jià)疫苗是否能夠引發(fā)Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)的定量指標(biāo)。

總IgG1抗體水平檢測(cè)、各樣本組胺和白三烯的含量檢測(cè)方法建立后，選取恥垢疫苗作為結(jié)核病新疫苗的代表，應(yīng)用已建立的方法對(duì)其進(jìn)行免疫毒性評(píng)價(jià)。免疫毒性評(píng)價(jià)除設(shè)立疫苗評(píng)價(jià)組外，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。結(jié)果顯示恥垢疫苗組豚鼠血清總IgG1抗體水平、各樣本上清液中的組胺和白三烯含量均與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卻與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明恥垢疫苗具有很好的臨床前安全性。恥垢疫苗是已經(jīng)取得臨床批件的疫苗，并完成了Ⅰ期臨床研究，臨床研究資料顯示其具有很好的安全性，這與本次實(shí)驗(yàn)的豚鼠模型評(píng)價(jià)結(jié)果相一致。

實(shí)驗(yàn)研究建立了幾種可以量化的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，這將是國(guó)內(nèi)首次對(duì)疫苗可能引起的豚鼠Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行客觀、可量化的評(píng)價(jià)，并為今后對(duì)其他各種疫苗特別是結(jié)核病疫苗的安全性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

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