高通量篩選在微生物制藥中的應(yīng)用進(jìn)展

沈辰，鄭珩，顧覺(jué)奮

高通量篩選（high throughput screening，HTS）又稱大規(guī)模集群式篩選，是由高容量化合物庫(kù)、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測(cè)、高特異篩選模型、高效率數(shù)據(jù)處理 5 個(gè)子系統(tǒng)有機(jī)組合而成，是一種新型、高自動(dòng)化、高靈敏度、高通量的發(fā)現(xiàn)新藥的篩選技術(shù)。其理論基礎(chǔ)是反向藥理學(xué)（reverse pharmacology），即基于受體、酶及離子通道等分子、細(xì)胞水平藥物作用靶點(diǎn)，從現(xiàn)有化合物庫(kù)中篩選出具有生物活性的先導(dǎo)化合物，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行組織、器官及疾病相關(guān)動(dòng)物模型研究。

利用藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，已成功地發(fā)現(xiàn)了大批臨床用藥。如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利、依那普利等降血壓藥物，β-腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾、阿替洛爾等，都是利用分子靶點(diǎn)篩選發(fā)現(xiàn)并經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究而成為臨床應(yīng)用的藥物。這些研究成果更加強(qiáng)了人們對(duì)高通量藥物篩選的信心。目前，世界上大型制藥企業(yè)都無(wú)一例外地將其作為驅(qū)動(dòng)新藥發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)力引擎，紛紛引進(jìn)新藥研發(fā)領(lǐng)域，使高通量篩選的形式和內(nèi)容不斷豐富發(fā)展[1]。近年來(lái)，高通量篩選技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于化學(xué)新藥的篩選，同時(shí)在生物催化劑[2]，RNAi[3]，蛋白質(zhì)類藥物[4]等的篩選過(guò)程中也有所應(yīng)用。

高通量篩選技術(shù)具有以下幾方面的發(fā)展趨勢(shì)：①采用基于細(xì)胞的分析篩選方法，可直接在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)化合物，提高篩選的準(zhǔn)確性；②采用精確的檢測(cè)技術(shù)，使之能夠在相同的分析過(guò)程中兼顧效率和特異性；③基于功能基因組學(xué)的藥物高通量篩選逐漸受到重視并應(yīng)用；④開(kāi)始分析和處理工業(yè)中的實(shí)際問(wèn)題。該系統(tǒng)在后基因組時(shí)代研究和藥物發(fā)現(xiàn)之間架起橋梁，將很快滲入到未來(lái)市場(chǎng)中，打破從基因到藥物研發(fā)鏈條中的瓶頸[5]。

1 高通量篩選應(yīng)用于微生物藥物早期發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)勢(shì)

高通量篩選技術(shù)主要應(yīng)用于篩選利用組合化學(xué)制備的大規(guī)?；衔飵?kù)[6]，雖然篩選效率大為提高，但得勢(shì)不得力，其獲得新的化學(xué)實(shí)體的數(shù)量并沒(méi)有顯著提高，而且隨著新藥標(biāo)準(zhǔn)的提高，新的化學(xué)實(shí)體數(shù)量反而呈下降趨勢(shì)。因此，天然產(chǎn)物作為創(chuàng)新藥物的篩選資源再次受到重視[7]。

相對(duì)于動(dòng)植物代謝產(chǎn)物來(lái)講，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有更易開(kāi)發(fā)利用、不破壞生態(tài)環(huán)境、可通過(guò)發(fā)酵大量獲得和易于采用生物技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前已有眾多微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)成為藥物?？股刈鳛槠渲械牡湫痛?，在治療感染性疾病，保障人類健康方面取得了令人矚目的成就。同時(shí)它不僅應(yīng)用于臨床，也可用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，是一類應(yīng)用最廣泛的藥物。隨著生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，由微生物產(chǎn)生的具有其他生理活性的物質(zhì)也不斷被發(fā)現(xiàn)，如受體拮抗劑和激動(dòng)劑、酶抑制劑和誘導(dǎo)劑、免疫調(diào)節(jié)劑等，更豐富了微生物藥物生理活性的多樣性。

近年來(lái)隨著人們對(duì)極端環(huán)境微生物，海洋微生物的探索，發(fā)現(xiàn)了大量未知的微生物物種及微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。同時(shí)伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在基因工程、代謝工程、組合生物合成的推動(dòng)下，通過(guò)構(gòu)建工程菌株，獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，擴(kuò)充著微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量[9]。利用有效的篩選手段對(duì)其進(jìn)行篩選，將極大地促進(jìn)創(chuàng)新型微生物藥物的早期發(fā)現(xiàn)和苗頭化合物的獲得。而傳統(tǒng)的篩選方法由于處理量少，效率低，面對(duì)大批量化合物處理時(shí)，需要消耗更多的人力和物力，已不能適應(yīng)當(dāng)前大規(guī)模微生物代謝產(chǎn)物的篩選要求。高通量篩選技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)篩選方法的不足，能夠快速而高效地在龐大的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫(kù)中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物。隨著微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫(kù)的建立和日趨完善，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的篩選更加方便和快捷，對(duì)我國(guó)創(chuàng)新微生物藥物的開(kāi)發(fā)起到極大的推動(dòng)作用。

2 微生物藥物高通量篩選樣品庫(kù)發(fā)展現(xiàn)狀

目前微生物制藥領(lǐng)域中可供高通量篩選的樣品資源庫(kù)主要包括微生物菌株庫(kù)及微生物發(fā)酵產(chǎn)物提取品庫(kù)等。

隨著化學(xué)分離手段的進(jìn)步與發(fā)展，以及我國(guó)在藥物研發(fā)經(jīng)費(fèi)投入的加大，在我國(guó)開(kāi)展規(guī)模化微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物純品庫(kù)已經(jīng)成為可能，而且也十分必要，這是創(chuàng)新型微生物藥物快速高效發(fā)現(xiàn)的必然要求。

在我國(guó)，科技部自“九五”期間開(kāi)始資助支持國(guó)內(nèi)籌建國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室，“十五”、“十一五”期間又以篩選平臺(tái)的形式資助支持微生物藥物高效篩選。十年來(lái)，我國(guó)微生物藥物的篩選技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。在藥物篩選微生物資源方面已經(jīng)建立了近 15 萬(wàn)株的篩選用菌株庫(kù)和 20 萬(wàn)個(gè)微生物發(fā)酵液提取品的樣品庫(kù)。高通量微生物藥物篩選模型已達(dá)到 150 種，年篩選量已由“十五”期間的20 萬(wàn)樣次，發(fā)展到“十一五”期間的 100 萬(wàn)樣次。通過(guò)大量的規(guī)模化的篩選，已經(jīng)獲得一批藥物先導(dǎo)化合物和藥物候選物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段。就微生物藥物的篩選規(guī)模和水平來(lái)講，我國(guó)的創(chuàng)新微生物藥物篩選已達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平[8, 10]。

3 高通量篩選在微生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

高通量篩選技術(shù)不僅推動(dòng)了創(chuàng)新型化學(xué)類新藥的研發(fā)進(jìn)程，近年來(lái)，在創(chuàng)新型微生物類新藥研發(fā)過(guò)程中的應(yīng)用也日趨廣泛。以下主要介紹近年來(lái)高通量篩選技術(shù)在微生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的兩個(gè)方面——先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及菌種篩選。

3.1 在微生物來(lái)源的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

3.1.1 針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)的高通量篩選 針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)的高通量篩選過(guò)程一般為首先構(gòu)建適宜的高通量篩選模型，再利用微量滴定板對(duì)微生物代謝產(chǎn)物庫(kù)中的化合物進(jìn)行高通量篩選，通過(guò)相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)篩選目標(biāo)化合物，最后對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證，以獲得可供進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)化合物。

正如前文所述，國(guó)家新藥（微生物）篩選中心樣品庫(kù)的建立和發(fā)展已極大地促進(jìn)了微生物藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究者根據(jù)不同靶點(diǎn)，對(duì)樣品庫(kù)中的化合物進(jìn)行篩選，已經(jīng)獲得了大量微生物來(lái)源的具有不同生理活性的先導(dǎo)化合物。

在丙型肝炎病毒（HCV）絲氨酸蛋白水解酶抑制劑的高通量篩選過(guò)程中，李健蕊等[11]利用基因重組的方法將含有絲氨酸蛋白水解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）成功構(gòu)建了適用于高通量篩選的特異性蛋白酶抑制劑篩選模型。利用此模型，對(duì)樣品庫(kù)中的 4000 個(gè)化合物進(jìn)行初步篩選，獲得了 4 個(gè)具有抗丙肝病毒活性的化合物。

在以 FOXP3 為靶點(diǎn)的免疫抑制劑的高通量篩選過(guò)程中，巫曄翔等[12]將轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3 基因啟動(dòng)子克隆至含有與報(bào)告基因 β-內(nèi)酰胺酶相偶聯(lián)的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染至Jurkat 細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)，建立了適宜高通量篩選的模型，進(jìn)而對(duì)樣品庫(kù)中 2500 余種化合物進(jìn)行篩選，獲得 4 個(gè)具有免疫抑制活性的化合物。

在以 ApoA-1 為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑的高通量篩選過(guò)程中，杜郁等[13]構(gòu)建了重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞 HepG2，利用熒光素酶表達(dá)活性的變化為檢測(cè)指標(biāo)，成功構(gòu)建了 ApoA-1 基因表達(dá)上調(diào)劑高通量篩選模型。對(duì)樣品庫(kù)中 5000 余種化合物進(jìn)行篩選，獲得4 個(gè)具有治療動(dòng)脈粥樣硬化潛力的活性化合物。

由此可見(jiàn)，以微生物代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)為對(duì)象的篩選，與組合化學(xué)品庫(kù)的高通量篩選雖然篩選對(duì)象不同，但原理與方法基本相同，所以該方法較為成熟、規(guī)范。

3.1.2 針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品庫(kù)的高通量篩選 微生物代謝產(chǎn)物中含有大量不為人知的新型化合物，在現(xiàn)有的微生物代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)中不能保證完全收納。同時(shí)，不同類型的微生物代謝產(chǎn)物的藥理活性會(huì)有所側(cè)重，在針對(duì)某一靶點(diǎn)篩選先導(dǎo)化合物時(shí)，選擇特定類型的微生物的代謝產(chǎn)物提取物進(jìn)行篩選，將會(huì)提高效率，事半功倍。所以針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品的高通量篩選是十分必要的，是對(duì)微生物天然代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)高通量篩選的重要補(bǔ)充。

針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品庫(kù)的高通量篩選過(guò)程，通常是將微生物發(fā)酵提取物加入到微量滴定板中，通過(guò)相應(yīng)的篩選模型，從大規(guī)模的微生物發(fā)酵液提取物中獲得目標(biāo)陽(yáng)性樣品——特定菌株發(fā)酵液提取物，進(jìn)而對(duì)特定菌株進(jìn)行放大發(fā)酵、活性產(chǎn)物提取、分離，獲得活性組分后進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和藥理活性測(cè)定，以得到先導(dǎo)化合物。

在 H1N1 神經(jīng)酰胺酶抑制劑的篩選過(guò)程中，Lin 等[14]利用基因工程手段將截短型 H1N1 神經(jīng)酰胺酶基因克隆到載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，獲得了能夠分泌表達(dá)截短型 H1N1 神經(jīng)酰胺酶的重組菌株，構(gòu)建了新型神經(jīng)酰胺酶抑制劑的高通量篩選模型。利用此模型對(duì)20 000 多個(gè)微生物發(fā)酵液提取物進(jìn)行了篩選，獲得 6 種活性提取物。

近年來(lái)，隨著海洋微生物，極端環(huán)境微生物的探索與開(kāi)發(fā)，大量的新型菌株以及獨(dú)特結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，這為創(chuàng)新微生物藥物的研發(fā)開(kāi)辟了新的思路?？蒲腥藛T通過(guò)對(duì)大量的海洋或極端環(huán)境等新分離菌株發(fā)酵提取品進(jìn)行高通量篩選，獲得了更多具有獨(dú)特生理活性的天然產(chǎn)物及其生產(chǎn)菌株。

在鈣調(diào)磷酸激酶抑制劑的篩選過(guò)程中，Margassery 等[15]對(duì)海洋微生物發(fā)酵提取品進(jìn)行了高通量篩選。研究者將含有CDRE::lacZ 融合基因的 Pmrk212 質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，獲得酵母報(bào)告菌株，以紫外吸收光譜作為檢測(cè)方法，構(gòu)建了鈣調(diào)磷酸激酶抑制劑的高通量篩選模型。然后對(duì) 81 個(gè)海洋海綿動(dòng)物中所分離的微生物發(fā)酵提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)菌株的發(fā)酵提取物具有鈣調(diào)磷酸激酶抑制活性，其菌株編號(hào)分別為 SM8、FMK7A、FMK1B。

總之，針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的高通量篩選，可分別以微生物天然代謝產(chǎn)物化合物庫(kù)及微生物發(fā)酵提取物為篩選對(duì)象來(lái)進(jìn)行，兩者互相滲透，相輔相成，其最終目標(biāo)均為高效率地獲得藥物先導(dǎo)化合物。近年來(lái)，高通量篩選技術(shù)在微生物來(lái)源的先導(dǎo)化合物早期發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)蓬勃發(fā)展，并在創(chuàng)新型微生物藥物的開(kāi)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮了極大的作用。表 1 總結(jié)了國(guó)內(nèi)近年來(lái)微生物代謝產(chǎn)物高通量篩選的部分案例。

3.2 在菌株篩選中的應(yīng)用

微生物具有數(shù)量大，種類多，分布廣的特點(diǎn)，絕大部分微生物菌種并未充分開(kāi)發(fā)，潛力巨大。因此，從大量的微生物菌株中篩選出所期望的目標(biāo)菌株，在微生物藥物發(fā)現(xiàn)的過(guò)程中具有重要的意義。

針對(duì)微生物菌株的高通量篩選，其目的是獲得具有某一特定性質(zhì)的菌株，篩選對(duì)象可以是自然界中分離所得的菌株，可以是原始菌株的突變株，也可以是通過(guò)生物技術(shù)改造的工程菌株等。在篩選過(guò)程中，開(kāi)發(fā)合適的培養(yǎng)基，對(duì)微生物進(jìn)行適宜微量滴定板的縮小化培養(yǎng)，以便將微生物菌株直接置于微量滴定板中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。利用多種檢測(cè)技術(shù)對(duì)目的產(chǎn)物的濃度或菌株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，獲得陽(yáng)性菌株，進(jìn)而通過(guò)復(fù)篩，最終獲得目的菌株——某一特定性質(zhì)的菌株。

表 1 國(guó)內(nèi)微生物代謝產(chǎn)物高通量篩選案例小結(jié)

表 2 國(guó)內(nèi)微生物菌株高通量篩選案例小結(jié)

Gao 等[19]利用高通量篩選方法，從原始菌株 Streptomyces avermitilis 系列突變株中成功篩選出阿維菌素高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量提高 60%。在高通量篩選模型的構(gòu)建過(guò)程中，研究者利用固體培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液體培養(yǎng)基，從而可在 96 孔微量滴定板中成功培養(yǎng) S.avermitilis 系列突變株。同時(shí)利用245 nm 紫外吸收值檢測(cè)阿維菌素的產(chǎn)量來(lái)代替高效液相色譜的檢測(cè)方法，適合于對(duì)微量滴定板的檢測(cè)。利用建立好的高通量篩選模型，對(duì)由原始菌株突變所獲得的 738 株突變株進(jìn)行了高通量篩選。其中在初篩（preliminary screen）過(guò)程中采用了高通量篩選技術(shù)。經(jīng)過(guò)初篩共獲得 116 株進(jìn)入復(fù)篩階段（second screen），最終證實(shí)有 38 株的產(chǎn)量比原始菌株提高了 10%。

針對(duì)微生物菌株的高通量篩選，是高通量篩選技術(shù)在微生物制藥領(lǐng)域中的一個(gè)獨(dú)特的應(yīng)用，在我國(guó)，近年來(lái)也涌現(xiàn)出一些相關(guān)的案例（表 2）。

4 小結(jié)

微生物代謝產(chǎn)物因其種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、材料等領(lǐng)域中，是自然界的寶貴財(cái)富，但正是因其龐大的數(shù)量，一般的篩選方法僅能對(duì)少量的代謝產(chǎn)物或菌株進(jìn)行篩選，這便大大限制了人類對(duì)于微生物天然代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用。高通量篩選作為 20 世紀(jì) 80 年代興起的方法，如今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化合物篩選中。近幾年，高通量篩選新技術(shù)的發(fā)展也大大提高了篩選效率，推動(dòng)了一大批化合物進(jìn)入臨床研究。在微生物制藥領(lǐng)域中高通量篩選也逐漸滲入并發(fā)揮了積極的作用，但還存在一些問(wèn)題：第一，高通量篩選主要關(guān)注于小分子化合物庫(kù)的篩選，而在微生物代謝產(chǎn)物中的篩選涉足較少；第二，專門(mén)的微生物代謝產(chǎn)物庫(kù)并未系統(tǒng)化建立；第三，新的作用靶點(diǎn)和微量分析方法還需要進(jìn)一步探索?？傊咄亢Y選作為新興的篩選手段，與現(xiàn)代藥物篩選技術(shù)結(jié)合并應(yīng)用于微生物代謝產(chǎn)物的篩選過(guò)程中，將會(huì)極大地推動(dòng)微生物制藥的發(fā)展。

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