重組人血清白蛋白/干擾素α2a融合蛋白的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及安全性評(píng)價(jià)

富巖，馬金玲，孫麗，杜杰，張延林，徐楠楠，孫云霞，于在林

Issacs 和 Lindeman 于 1957 年首先報(bào)道用滅活流感病毒攻擊人網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞后產(chǎn)生一種新的分子量在 20 000 ～ 30 000 D 的非特異性可溶的小分子糖蛋白，其是在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中產(chǎn)生的，被命名為干擾素（interferon，IFN）[1]。其后的研究表明這是一類多功能的細(xì)胞因子，當(dāng)機(jī)體受病毒攻擊后分泌，并與細(xì)胞受體結(jié)合，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)和酶類，來(lái)抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄和降解病毒 RNA 來(lái)控制病毒的生長(zhǎng)繁殖及發(fā)揮抗腫瘤的活性。重組人干擾素 α（recombinant human interferon alpha，rhIFNα）的應(yīng)用就成為病毒性疾病和腫瘤疾病治療的重要手段。臨床上它是慢性病毒性肝炎的特效藥，對(duì)伴有 HBV-DNA、DNA多聚酶陽(yáng)性或 HBeAg 陽(yáng)性等病毒復(fù)制標(biāo)志的成年慢性活動(dòng)性乙型肝炎、伴有 HCV 抗體陽(yáng)性和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）增高，但不伴有肝功能代償失調(diào)（Child 分類 A）的成年急慢性丙型肝炎、以及尖銳濕疣、帶狀皰疹、小兒病毒性肺炎及上呼吸道感染、慢性宮頸炎、丁型肝炎等的治療具有顯著療效[2]；對(duì)腫瘤疾病，如毛狀細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性白血病以及卡波濟(jì)肉瘤、腎癌、喉乳頭狀瘤、黑色素瘤、蕈樣肉芽腫、膀胱癌、基底細(xì)胞癌等重大疾病具有明確的治療作用[3]。重組干擾素的體內(nèi)半衰期約為 3.5 h，患者需要每天或隔天注射給藥 1 次，治療期長(zhǎng)達(dá) 6 個(gè)月至 1 年，患者依從度低，嚴(yán)重影響治療效果。為此亟需研發(fā)長(zhǎng)效的重組干擾素。PEG 化重組干擾素是在成品重組干擾素的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)修飾，達(dá)到每周給藥 1 次的良好效果，但是生產(chǎn)成本高，患者的治療費(fèi)用極高。我們研發(fā)了一系列低成本的重組人血清白蛋白與治療用細(xì)胞因子融合蛋白長(zhǎng)效新藥，目的是在保持細(xì)胞因子（包括干擾素）治療作用的同時(shí)，大大延長(zhǎng)重組蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)半衰期，用于多種重大疾病的治療，并已進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。新藥在臨床使用中將降低給藥頻率，減少患者痛苦，提高治療的順應(yīng)性和依存度，相比市場(chǎng)上現(xiàn)有的蛋白質(zhì)藥物將有更長(zhǎng)的血液半衰期，更顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[4-6]。

2002 年，Osborn 等報(bào)道了重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白在小鼠和大鼠中的毒理學(xué)研究以及食蟹猴中的藥代動(dòng)力學(xué)的初步研究結(jié)果[7-8]，隨后開(kāi)展了臨床試驗(yàn) I 期[9]、II 期[10]和 III期[11]研究和對(duì)其成藥性研究的綜述[12]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明其每 2 周給藥 1 次不遜于 PEG-rhIFNα2a每周給藥 1 次的臨床試驗(yàn)結(jié)果[13]。干擾素 α2b 與干擾素 α2a 雖然僅第 23 位氨基酸不同，但國(guó)內(nèi)外作為兩個(gè)不同的藥物研發(fā)和在臨床上應(yīng)用。重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a）則是首次以新藥研發(fā)為目的開(kāi)展臨床前研究。為此結(jié)合國(guó)家有關(guān)新藥注冊(cè)法規(guī)規(guī)定及生物（基因工程）制品的特點(diǎn)，作者開(kāi)展了極為完整和詳盡的系統(tǒng)藥理學(xué)、毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)以及藥效學(xué)和藥代/毒代研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠（SPF 級(jí)）170 只、Beagle 狗 12 只（普通級(jí)）、Wistar 大鼠（SPF 級(jí)）405 只、食蟹猴（普通級(jí)）47 只分別購(gòu)自于中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、福州振和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所以及廣西新豐源生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)涉及的所有動(dòng)物處理內(nèi)容均遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理和動(dòng)物福利相關(guān)條例和法規(guī)，并由北京昭衍新藥研究中心有限公司的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和監(jiān)督執(zhí)行。研究者已努力做到最大可能地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)量。

1.1.2 供試品、試劑及檢測(cè)試劑盒 注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白凍干粉針劑由天津林達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為9213/20090101，規(guī)格為每支 1.5 mg/ml；批號(hào)為9213/20090102 和 9213/20090201，規(guī)格均為每支2 mg/ml；陽(yáng)性對(duì)照藥聚乙二醇干擾素 α2a 注射液（派羅欣，Pegasys）由 Roche Pharma（Schweiz）Ltd. 生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝，批號(hào)為B1129，規(guī)格為 1.80 × 105IU/支，每支 0.5 ml。其他試劑為藥用級(jí)、分析級(jí)純度。HBsAg 和 HBeAg ELISA 檢測(cè)試劑盒，國(guó)藥準(zhǔn)字 S10960066，尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司生產(chǎn)；乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒，國(guó)藥準(zhǔn)字：S20020033，深圳匹基生物工程有限公司生產(chǎn)；Human IFN-α ELISA 試劑盒 Cat#BMS216，Bender MedSystems 生產(chǎn)；2-5oas（2'-5' 寡腺苷酸合成酶）試劑盒，貨號(hào) I-AP75，由 Eiken Chemical Co., Ltd 生產(chǎn)。

1.1.3 儀器 Bayer Advia 2120 全自動(dòng)血球分析儀為美國(guó) Bayer 公司產(chǎn)品；MP150 多導(dǎo)生理記錄儀為美國(guó) Biopac 公司產(chǎn)品；ep Mastercycler 2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀為德國(guó) Eppendorf 公司的產(chǎn)品；TBA-120FR 型全自動(dòng)生化分析儀為日本東芝公司產(chǎn)品；Easylyte 型全自動(dòng)電解質(zhì)分析儀為美國(guó)Medica 公司的產(chǎn)品；高效液相色譜儀 Shimadzu LC-10AT 為日本島津公司產(chǎn)品；TSK G3000 SWxl 300 A，10 μm，7.8 mm × 300 mm 的凝膠柱購(gòu)自日本 Tosoh 公司；酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad 公司或Thermo 公司的 Multiskan MK3 酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 藥效學(xué)研究

1.2.1.1 對(duì) HepG2 2.2.15 細(xì)胞的體外毒性及抗HBV 活性檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 HepG2 2.2.15細(xì)胞，經(jīng) 0.25% 胰酶消化后配制成 5 × 104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 100 μl，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 48 h，然后吸去上清液，加入梯度稀釋后不同濃度的藥物。設(shè)培養(yǎng)液陰性對(duì)照組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組，各組均至少 3 個(gè)復(fù)孔。將受試藥物用含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)液配制成 1:4 溶液，2 倍稀釋加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每天換同濃度藥液，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng) 72 h。每孔加入 PBS 配制的 5 mg/ml MTT 溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸棄培養(yǎng)液上清，每孔加150 μl DMSO 溶液，振蕩 10 min，使結(jié)晶充分溶解，A570nm 比色，測(cè)定 OD 值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR%）=（對(duì)照組 OD 值 － 給藥組 OD 值）/對(duì)照組 OD 值 × 100%。采用 Logit 法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值，并與陽(yáng)性藥物進(jìn)行比較。

HBV DNA 拷貝數(shù)的熒光定量 PCR 檢測(cè)、乙肝病毒表面抗原（s）和核心抗原（e）的檢測(cè)分別按試劑盒生產(chǎn)廠商提供的方法開(kāi)展檢測(cè)，并對(duì)曲線的準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和線性指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。線性標(biāo)準(zhǔn)要求標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率在 0.8 ～ 1.2 之間，相關(guān)系數(shù) r2大于 0.99，精密度和重復(fù)性要求各重復(fù)孔間標(biāo)準(zhǔn)差小于 1.0，準(zhǔn)確度要求檢出值偏差小于 20%；計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的藥物相對(duì)抑制率。供試品與陽(yáng)性對(duì)照藥相同濃度的抑制率相差小于20% 時(shí)判為無(wú)差異。

1.2.1.2 rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內(nèi)的藥效學(xué)及藥效動(dòng)力學(xué)研究 試驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]描述。取20 只食蟹猴，雌雄各半。注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白分為低（10 μg/kg）、中（40 μg/kg）、高（160 μg/kg）劑量組，靜脈給藥組（40 μg/kg）以及派羅欣對(duì)照組（10 μg/kg)，每組4 只，雌雄各半。其中低劑量組兼做連續(xù)給藥組，每 2 周給藥 1 次，共給藥 4 次。同時(shí)檢測(cè)低、高劑量組給藥后血清中 2-5oas 濃度的變化情況。各組血漿藥物濃度由經(jīng)驗(yàn)證的 ELISA 方法進(jìn)行測(cè)定，方法定量的下限在 0.156 ng/ml。同時(shí)采用 RIA法測(cè)定低、高劑量組藥后血清中 2-5oas 的濃度，方法靈敏度在 10 pmol/dl。

1.2.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

1.2.2.1125I-rHSA/IFNα2a 在小鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。用小鼠考察藥物在體內(nèi)的分布，采用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白的方法結(jié)合分子排阻色譜（SHPLC）對(duì)經(jīng)同位素（Na125I）標(biāo)記的 rHSA/IFNα2a 在小動(dòng)物體內(nèi)的分布、排泄過(guò)程及血漿蛋白結(jié)合等方面進(jìn)行研究，方法的定量下限在 0.01 ng-當(dāng)量（放射性）。125I-rHSA/IFNα2a 的給藥劑量小鼠為 2 μg/只。

1.2.2.2125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 方法同 1.2.2.1，125I-rHSA/IFNα2a的給藥劑量大鼠為 10 μg/只。

1.2.3 安全性評(píng)價(jià)

1.2.3.1 安全藥理學(xué)研究

⑴ rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對(duì)正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。設(shè) 100、300、600 μg/kg 劑量組及生理鹽水陰性對(duì)照組，每組 10 只小鼠，均 5 雄 5 雌。分別于給藥后 6、24 h 進(jìn)行自主活動(dòng)試驗(yàn)，給藥后 6 小時(shí) 10 分鐘、給藥后 24 小時(shí) 10 分鐘進(jìn)行攀網(wǎng)試驗(yàn)，給藥后6 h 進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下催眠試驗(yàn)。

⑵ rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對(duì)犬心血管和呼吸系統(tǒng)功能的影響：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。設(shè) 50、200 μg/kg 劑量組及生理鹽水陰性對(duì)照組，每組6 只動(dòng)物，均 3雄 3 雌。對(duì)照組動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束后，間隔 7 ～ 8 d 消除期后用于低劑量組試驗(yàn)。單次皮下注射給予犬，觀察對(duì)其心血管和呼吸系統(tǒng)的各項(xiàng)參數(shù)的變化。

1.2.3.2 單次給藥的毒性研究

⑴ rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給予小鼠的毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]，試驗(yàn)用昆明小鼠 60 只，設(shè) 3 組，分別是靜脈注射對(duì)照組、肌肉注射給藥組和靜脈注射給藥組，每組20 只，雌雄各半。給藥容量為 0.5 ml/只，給藥劑量為 50 000 μg/kg 體重，對(duì)照組靜脈注射給予等容量的生理鹽水。藥后連續(xù)觀察 14 d。

⑵ rHSA/IFNα2a 單次皮下和靜脈注射給予食蟹猴的毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。試驗(yàn)用食蟹猴 3 只，皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素α2a 融合蛋白 10 mg/kg體重，給藥容量為 5 ml/kg體重，給藥后連續(xù)觀察 14 d。試驗(yàn)中進(jìn)行一般生理指標(biāo)的觀察、體溫、體重、心電圖、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血凝指標(biāo)、血液生化等指標(biāo)的檢測(cè)，對(duì)死亡動(dòng)物和安樂(lè)死動(dòng)物進(jìn)行解剖檢查，異常改變進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.3.3 反復(fù)給藥的毒性研究

⑴ rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予大鼠13 周的毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。試驗(yàn)選用160 只 Wistar 大鼠，分性別按體重隨機(jī)分為 4 組，每組 40 只，雌雄各半，分別為生理鹽水對(duì)照組、rHSA/IFNα2a 100、300 和 1000 μg/kg 劑量組，皮下注射給藥，每周 1 次，連續(xù)給藥 13 周。在給藥 4 周（雌雄各 5 只）和末次給藥后（雌雄各10 只）將部分動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死，剩余動(dòng)物于末次給藥 4 周后進(jìn)行安樂(lè)死。試驗(yàn)期間，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行臨床觀察，體重、食量、體溫、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、血液生化、骨髓涂片、眼科、T 淋巴細(xì)胞亞群分布和特異性抗體等指標(biāo)的檢查，對(duì)安樂(lè)死動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，主要臟器稱重，并對(duì) 40 多種組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。另外將血清樣品稀釋后，用 Wish 細(xì)胞-VSV/MTT 比色法測(cè)定生物學(xué)活性來(lái)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體是否具有中和藥物活性的作用。

⑵ rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴13 周的毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。試驗(yàn)選用24 只食蟹猴，按性別隨機(jī)區(qū)段法分成 4 組，每組6 只，雌雄各半，分別為生理鹽水對(duì)照組，rHSA/IFNα2a 的 50、150 和 500 μg/kg 劑量組。皮下注射給藥，每周給藥 1 次，連續(xù)給藥 13 周，共給藥 14 次。末次給藥后次日每組安樂(lè)死 4 只動(dòng)物（雌雄各半）；將剩余動(dòng)物恢復(fù) 4 周后安樂(lè)死。試驗(yàn)期間進(jìn)行了一般臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血液學(xué)、血液生化、骨髓涂片、尿液、眼科、T 淋巴細(xì)胞亞群分布和抗體等指標(biāo)檢查，同時(shí)進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。動(dòng)物安樂(lè)死后進(jìn)行大體解剖、主要臟器稱重，并對(duì) 40 多種器官組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。中和抗體檢查同 1.2.3.3 ⑴。

1.2.3.4 rHSA/IFNα2a 的大鼠 II 段生殖毒性試驗(yàn) Wistar 雌性受孕大鼠分為 4 組，每組 30 只。供試品設(shè)低劑量組（20 μg/kg）、中劑量組（200 μg/kg）和高劑量組（1000 μg/kg），同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，皮下注射給藥，孕鼠于妊娠第 6 天開(kāi)始給藥，每3 天給藥 1 次，每只孕鼠共給藥 3 次。在妊娠第20 天對(duì)孕鼠實(shí)施安樂(lè)死。試驗(yàn)中進(jìn)行一般觀察，對(duì)體重、食量、孕鼠生殖能力、胎仔骨骼內(nèi)臟進(jìn)行檢查。

2 結(jié)果

2.1 藥效學(xué)研究

干擾素在藥效學(xué)試驗(yàn)上并沒(méi)有一個(gè)適當(dāng)和穩(wěn)定重復(fù)可供使用的動(dòng)物模型。在重組干擾素和 PEG化重組干擾素的藥效學(xué)研究中，使用體外抗病毒的效果來(lái)觀察供試品干擾素的藥效，同時(shí)測(cè)定受試動(dòng)物體內(nèi)的 2-5oas 的活性，給出抗病毒的藥效反應(yīng)水平。重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白（rHSA/IFNα2a，分子量為 85.7 kD）對(duì)病毒病的治療作用、主要藥效學(xué)試驗(yàn)也按重組干擾素和長(zhǎng)效的PEG 化重組干擾素 α2a（派羅欣，分子量約 40 kD）的藥效評(píng)價(jià)方法進(jìn)行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)，并與之相比較，以期為進(jìn)一步的臨床前藥效和安全性評(píng)價(jià)及臨床試驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。

2.1.1 對(duì) HepG2 2.2.15 細(xì)胞的體外毒性及藥物的抗 HBV 活性檢測(cè) 藥效學(xué)試驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照品是聚乙二醇與重組干擾素 α2a 結(jié)合形成的長(zhǎng)效干擾素 Pegasys，具有非聚乙二醇結(jié)合的 α-干擾素的體外抗病毒和抗增殖活性。因此，試驗(yàn)中選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照品。陰性對(duì)照品為生理鹽水（0.9% 氯化鈉注射液）。體外抗病毒試驗(yàn)選擇能夠分泌干擾素的乙型肝炎病毒 HBV 顆粒的 HepG2 2.2.15 細(xì)胞。兩次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：供試品 rHSA/IFNα2a在濃度為 3.13 × 103IU/ml 時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，此濃度為最大無(wú)毒濃度，其半數(shù)抑制濃度為 7.3 ×104IU/ml。陽(yáng)性對(duì)照派羅欣的最大無(wú)毒濃度小于3.13 × 103IU/ml，其半數(shù)抑制濃度為 5.7 × 104IU/ml。另外，系統(tǒng)控制采用化藥順鉑作為系統(tǒng)對(duì)照組。試驗(yàn)中系統(tǒng)對(duì)照組的抑制作用呈梯度，重復(fù)性好，表明整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程無(wú)異常。

2.1.1.1 HBV DNA 拷貝數(shù)的熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果 于給藥后第 1、3、5、7、9 天分別收集各組細(xì)胞上清液，熒光定量 PCR 檢測(cè) HBV DNA的拷貝數(shù)，待測(cè)樣本處于 5.0 × 102≤ HBV DNA ≤5.0 × 107時(shí)的檢測(cè)結(jié)果有效。陰性對(duì)照組 HepG2

2.2.15 細(xì)胞上清液中 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第 9 天時(shí) HBV DNA 檢測(cè)值明顯增加，約為第 1 天的 6 倍。結(jié)果表明試驗(yàn)選用的細(xì)胞分泌合成 HBV 正常穩(wěn)定。陽(yáng)性對(duì)照派羅欣組（1.0 × 103IU/ml）中 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也略有增加，其相對(duì)抑制率則隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第 3 天為 27.02%，第 9 天為74.08%，表明派羅欣對(duì) HBV DNA 拷貝數(shù)的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。供試品 rHSA/IFNα2a兩個(gè)劑量組的 HBV DNA 拷貝數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)略有增加，高劑量組（1.0 × 103IU/ml與派羅欣試驗(yàn)劑量相同）的抑制率在培養(yǎng)第 3 天為 41.41%，第9 天則為 69.96%，與派羅欣相同。此結(jié)果表明1.0 × 103IU/ml 的 rHSA/IFNα2a 對(duì) HBV DNA 復(fù)制的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，可以認(rèn)為供試品 rHSA/IFNα2a 對(duì) HBV DNA 復(fù)制的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照派羅欣的作用相似。重復(fù)試驗(yàn)與第一次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.1.1.2 乙肝病毒抗原表達(dá)檢測(cè) 乙肝病毒抗原HBsAg 和 HBeAg 的 ELISA 檢測(cè)方法采用常規(guī)試驗(yàn)操作規(guī)程將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，得到乙肝病毒抗原 HBsAg 和 HBeAg的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù) r2分別為 0.994 和0.995，均符合要求。

2.1.1.3 乙肝病毒表面抗原 HBsAg 分泌的ELISA 結(jié)果 陰性對(duì)照組 HepG2 2.2.15 細(xì)胞上清液中 HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第9 天為第 1 天的 4 倍左右。供試品 rHSA/IFNα2a組 HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也略有增加，但明顯低于陰性對(duì)照組，其相對(duì)抑制率（OD450對(duì)照組－OD450試驗(yàn)組）/OD450對(duì)照組× 100% 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第 7 天為 43.35%，第 9 天為52.53%，表明 rHSA/IFNα2a 對(duì) HBsAg 分泌的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照派羅欣組HBsAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也略有增加，明顯低于陰性對(duì)照組，其相對(duì)抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第 7 天為 60.10%，第 9 天為 66.34%，表明派羅欣對(duì) HBsAg 分泌的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。結(jié)果表明由于各時(shí)間點(diǎn)供試品 rHSA/IFNα2a 和陽(yáng)性對(duì)照派羅欣的相對(duì)抑制率差異不超過(guò) 20%，可以認(rèn)為兩者對(duì) HBsAg 分泌的抑制作用無(wú)差異。

2.1.1.4 乙肝病毒 HBeAg 分泌的 ELISA 結(jié)果 陰性對(duì)照組 HepG2 2.2.15 細(xì)胞上清液中HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第7 天為第 1 天的 5 倍左右，第 9 和第 7 天的表達(dá)量無(wú)明顯變化。供試品 rHSA/IFNα2a 組 HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也略有增加，但明顯低于陰性對(duì)照組，其相對(duì)抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第 7 天為 49.26%，而第 9 天為 30.15%，表明rHSA/IFNα2a 對(duì) HBeAg 分泌的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，第 7 天時(shí)抑制作用最強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照派羅欣組 HBeAg 分泌隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)也略有增加，明顯低于陰性對(duì)照組，其相對(duì)抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，培養(yǎng)第 7 天為 60.22%，第9 天為 50.99%，表明派羅欣對(duì) HBeAg 分泌的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，至第 7 天時(shí)抑制作用最強(qiáng)。除培養(yǎng)第 9 天陽(yáng)性對(duì)照派羅欣的相對(duì)抑制率高于供試品 rHSA/IFNα2a 組外（差異為40.87% ＞ 20%），其余各時(shí)間點(diǎn)兩組的差異不超過(guò)20%，第 7 天為抑制最強(qiáng)而第 9 天抑制作用減弱，可以認(rèn)為兩者對(duì) HBeAg 分泌的抑制作用基本無(wú)差異。在本項(xiàng)目的試驗(yàn)條件下，供試品 rHSA/IFNα2a 的最大無(wú)毒濃度為 3.13 × 103IU/ml，陽(yáng)性對(duì)照派羅欣的最大無(wú)毒濃度低于 3.13 × 103IU/ml。rHSA/IFNα2a 在濃度 1.0 × 103IU/ml 時(shí)，具有在體外抑制 HBsAg、HBeAg 分泌以及 HBV DNA 復(fù)制的作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制 HBV 復(fù)制活性的作用增強(qiáng)，其作用與長(zhǎng)效化的 PEG-干擾素——派羅欣相似。

2.1.2 對(duì) rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內(nèi)的藥效學(xué)及藥效動(dòng)力學(xué)研究 2-5oas 是 IFN 抗病毒、抗細(xì)胞增殖過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。由它催化合成的 2'-5'寡腺苷酸（2-5a）能激活細(xì)胞中的內(nèi)切核糖核酸酶（RNAse l），它可降解病毒的 mRNA 及細(xì)胞的RNA，從而起到抑制病毒復(fù)制和抗細(xì)胞增殖的作用。該酶可作為一項(xiàng)生化指標(biāo)用于評(píng)價(jià)機(jī)體 IFN系統(tǒng)的抗病毒藥效作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定 2-5oas活性來(lái)評(píng)價(jià) rHSA/IFNα2a 抗病毒作用。皮下注射給予食蟹猴 rHSA/IFNα2a 后，10 μg/kg 及 160 μg/kg組動(dòng)物血清中 2-5oas 濃度見(jiàn)表 1 及圖 1。從數(shù)據(jù)上看，10 μg/kg 組動(dòng)物平均血清 2-5oas 濃度在24 h 達(dá)峰，而 160 μg/kg 組則在 144 h 達(dá)峰，兩組動(dòng)物血清 2-5oas 達(dá)峰時(shí)間均晚于血漿藥物峰濃度時(shí)間，但在藥后 2 周，其平均血清 2-5oas 濃度基本回落至藥前水平（但高于藥前值）。證明 rHSA/IFNα2a 維持 2-5oas 酶活性可達(dá) 2 周，支持了每2 周給藥的可行性。

表 1 皮下注射后食蟹猴血漿中 2-5oas 含量（± s ，n = 4）Table 1 The content of 2-5oas in cynomolgus monkey serum after subcutaneous injection (±s , n = 4)

注：方法的準(zhǔn)確定量下限為 10 pmol/dl；*n = 3。Notes: The lower limitation of quantitative method is 10 pmol/dl; *n = 3.

不同劑量注射后血漿中 2-5oas 含量（pmol/dl）The content of 2-5oas in serum after injection with different doses (pmol/dl)時(shí)間（h）Time (h)10 μg/kg 160 μg/kg 0 46.52 ± 26.67 103.55 ± 155.41*10 159.49 ± 152.63* 176.99 ± 100.58 24 440.57 ± 653.69* 180.53 ± 87.87 48 88.80 ± 92.89 218.04 ± 213.87 96 228.41 ± 297.51* 260.26 ± 272.95 144 124.74 ± 132.16 571.75 ± 913.89 192 97.56 ± 79.88 289.63 ± 468.30 264 157.30 ± 185.86 147.98 ± 133.21 336 114.86 ± 116.68 151.55 ± 111.56

圖 1 血漿中 2-5oas 與 rHSA/IFNα2a 含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)對(duì)比圖（皮下注射 10 μg/kg，n = 4）Figure 1 The concentration of 2-5oas and rHSA/IFNα2a protein in cynomolgus monkey plasma with different time points after subcutaneous injection (dosage: 10 μg/kg, n = 4)

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1125I-rHSA/IFNα2a 在小鼠體內(nèi)的分布排泄研究 皮下注射給予小鼠后，125I-rHSA/IFNα2a 顯示主要分布在膀胱、頜下腺、血清及腎臟等組織/器官。眼球、脂肪及腦分布較少。表明該藥物主要經(jīng)腎臟排泄，并且藥物不易透過(guò)血-腦脊液屏障，其組織分布見(jiàn)圖 2。

2.2.2125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 皮下注射給予大鼠 10.0 μg/只后，125I-rHSA/IFNα2a 的 TCA 沉淀放射性的末端半衰期為（44.39 ± 4.45）h，Tmax為（10.33 ± 7.31）h，Cmax為（92.29 ± 24.27）ng-當(dāng)量/ml，AUC(0-168h)為（3.61 ± 0.50）h·μg-當(dāng)量/ml；AUCinf為（3.75 ±0.52）h·μg-當(dāng)量/ml；絕對(duì)生物利用度為 42.83%。rHSA/IFNα2a 在大鼠中的主要藥代參數(shù)見(jiàn)表 2；皮下和靜脈給藥后的藥物濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖 3。放射性藥物主要經(jīng)尿排泄，少量經(jīng)糞、膽汁排泄，皮下注射后 9 d，可排泄給入放射性總量的（88.85 ±4.09）%。試驗(yàn)表明本制品在體內(nèi)的去向清楚，清除基本徹底，無(wú)蓄積現(xiàn)象。125I-rHSA/IFNα2a 不與血漿蛋白結(jié)合。

圖 2 小鼠皮下注射 125I-rHSA/IFNα2a 后在組織中的分布圖Figure 2 The tissue distribution of mice after subcutaneous injection of 125I-rHSA/IFNα2a

表 2 125I-rHSA/IFNα2a 在大鼠體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 2 Metabolism kinetic parameters comparison of 125I-rHSA/IFNα2a in rats

圖 3 大鼠經(jīng)皮下和靜脈給予 125I-rHSA/IFNα2a 后血清放射性的變化Figure 3 The radioactivity in plasma of rats after injection of 125I-rHSA/IFNα2a by s.c. or by i.v.

2.2.3 rHSA/IFNα2a 在食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 單次皮下注射食蟹猴給藥后的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)：低（10 μg/kg）、中（40 μg/kg）、高（160 μg/kg）劑量組的 t1/2分別為（61.20 ± 6.03）、（83.57 ± 6.02）和（75.90 ± 16.35）h；Tmax分別為（13.00 ± 7.39）、（9.00 ± 1.15）和（21.00 ± 12.70）h；Cmax分別為（0.16 ± 0.04）、（0.59 ± 0.05）和（2.51 ± 0.34）μg/ml；AUC（0-336h）分別為（13.85 ± 1.00）、（61.88 ± 3.44）和（277.26 ± 18.69）h·μg/ml；AUCinf分別為（14.04± 1.21）、（62.96 ± 5.32）和（278.44 ± 19.59）h·μg/ml；Vd分別為（63.09 ± 6.88）、（77.00 ± 8.54）和（63.83± 18.47）ml/kg；Cl 分別為（0.72 ± 0.06）、（0.64 ±0.05）和（0.58 ± 0.04）ml/（h·kg）；MRT 分別為（78.60± 9.54）、（91.56 ± 9.80）和（83.23 ± 20.68）h；絕對(duì)生物利用度分別為 99.24%，111.25%，123.01%，平均為（111.16 ± 11.89）%。

低、中、高劑量組間的劑量比為 1:4:16；Cmax之比為 1:3.67:15.57；AUCinf之比為 1:4.48:19.83，呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)特征。皮下注射給予食蟹猴后，rHSA/IFNα2a 在 10 ～ 160 μg/kg 劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)非線性動(dòng)力學(xué)特征（圖 4）；在動(dòng)物體內(nèi)的末端半衰期較長(zhǎng)，為 61.20 ～ 83.57 h；皮下注射給藥的絕對(duì)生物利用度平均為（111.16 ± 11.89）%。

圖 4 食蟹猴單次皮下注射各組血漿中 rHSA/IFNα2a 濃度-時(shí)間曲線Figure 4 The relationship of protein concentration and time points in plasma after a single injection monkey with different dosage by s.c.

統(tǒng)計(jì)分析比較，等劑量（10 μg/kg）的 rHSAIFNα2a 與對(duì)照組 Pegasys 比較，除 rHSA/IFNα2a的 t1/2長(zhǎng)于對(duì)照組，Cmax低于對(duì)照組外，其他參數(shù)未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)差異（表 3）。

與文獻(xiàn)報(bào)道的美國(guó) HGSI 公司研發(fā)的 rHSA/IFNα2b（Albuferon）的動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)相比[7-8]，考慮到有試驗(yàn)差異、動(dòng)物個(gè)體差異、被統(tǒng)計(jì)動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)量差異，以及 rHSA/IFNα2a 與 Albuferon 僅有一個(gè)氨基酸（干擾素 α2a 和 2b；K23R）不同等因素，兩者的試驗(yàn)結(jié)果差異不是十分顯著，具有可比性（表 4）。

2.3 安全性評(píng)價(jià)

2.3.1 安全藥理學(xué)研究

2.3.1.1 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對(duì)正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響 給藥后，各劑量組給藥動(dòng)物一般行為表現(xiàn)、姿勢(shì)、步態(tài)等未見(jiàn)異常，各劑量組給藥動(dòng)物的自主活動(dòng)數(shù)、攀網(wǎng)能力和戊巴比妥鈉閾下催眠引起的翻正反射消失數(shù)與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異。因此，認(rèn)為單次皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白在 100、300、600 μg/kg. 劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)明顯影響，與戊巴比妥鈉無(wú)協(xié)同作用。

表 3 等劑量 rHSA/IFNα2a 與 PEG-IFNα2a（派羅欣）代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（10 μg/kg，±s ，n = 4）Table 3 Metabolism kinetic parameters comparison of rHSA/IFNα2a with PEG-IFNα2a (Pegasys)(10 μg/kg,±s , n = 4)

表 3 等劑量 rHSA/IFNα2a 與 PEG-IFNα2a（派羅欣）代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較（10 μg/kg，±s ，n = 4）Table 3 Metabolism kinetic parameters comparison of rHSA/IFNα2a with PEG-IFNα2a (Pegasys)(10 μg/kg,±s , n = 4)

注：^派羅欣組 AUC 是 0-192 小時(shí)數(shù)據(jù)；#對(duì)應(yīng)于派羅欣的 10 μg/kg，P ≤ 0.05。Notes: ^AUC0-192h, for Pegasys group; #vs. Pegasys 10 μg/kg, P ≤ 0.05.

參數(shù)Parameters單位Unit rHSA/IFNα2a 派羅欣Pegasys t1/2 h 61.20 ± 6.03# 35.81 ± 4.91 Tmax h 13.00 ± 7.39 32.50 ± 18.79 Cmax μg/ml 0.16 ± 0.04# 0.41 ± 0.17 AUC(0-336h)^ h·μg/ml 13.85 ± 1.00 20.05 ± 5.22 AUCinf h·μg/ml 14.04 ± 1.21 20.71 ± 5.39 Vd ml/kg 63.09 ± 6.88# 25.65 ± 4.11 Cl ml/(h·kg) 0.72 ± 0.06# 0.51 ± 0.12 MRT h 78.60 ± 9.54# 52.00 ± 6.63

2.3.1.2 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射對(duì)狗心血管和呼吸系統(tǒng)功能的影響 給藥后，各劑量組動(dòng)物心電圖各參數(shù)值（心率、P-R 間期、P 波電壓、P 波間期、QRS 間期、Q-T 間期）與同一時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。未見(jiàn)異常心電圖波形，未發(fā)現(xiàn)對(duì)心臟傳導(dǎo)有影響。血壓指標(biāo)考察顯示各給藥組動(dòng)物的收縮壓、平均動(dòng)脈壓、舒張壓與同一時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差別。呼吸系統(tǒng)指標(biāo)考察顯示各給藥劑量組動(dòng)物的呼吸頻率和呼吸幅度與陰性對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差別。因此認(rèn)為單次皮下注射重組人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白在 50、200 μg/kg 劑量范圍內(nèi)對(duì)狗呼吸和心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響。

2.3.2 單次給藥的毒性研究

2.3.2.1 rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給予小鼠的毒性試驗(yàn) rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈注射給藥后，所有動(dòng)物均精神狀態(tài)良好、未出現(xiàn)死亡，給藥后第 14 天，肌肉注射給藥組的雄性動(dòng)物體重有所降低，未見(jiàn)其他明顯毒性反應(yīng)。大體解剖觀察各組織臟器未見(jiàn)異常。因此，在本試驗(yàn)條件下，rHSA/IFNα2a 單次肌肉和靜脈給予小鼠的最大耐受量（MTD）≥ 50 000 μg/kg體重，達(dá)到臨床擬用劑量（10 ～ 15/kg，60 kg/人）的 33 00 ～ 5000 倍。

2.3.2.2 rHSA/IFNα2a 單次皮下注射給予食蟹猴的毒性試驗(yàn) 給藥后 3 只動(dòng)物精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常；給藥后 2 h，3 只動(dòng)物體溫均有所升高；給藥后 1 周，3 只動(dòng)物體重均有下降的趨勢(shì)；3 只動(dòng)物的 RBC、HCT 和部分動(dòng)物的 PLT 在藥后有所降低，3 只動(dòng)物的 ALT 和 AST 在給藥后 1 d和 3 d 均呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，給藥后 2 周基本上恢復(fù)到了給藥前水平。未見(jiàn)其他明顯毒性反應(yīng)。大體解剖觀察各動(dòng)物織臟器未見(jiàn)異常。因此，在本試驗(yàn)條件下，rHSA/IFNα2a 單次皮下給予食蟹猴的最大耐受量 ≥ 10 mg/kg 體重，為臨床擬用劑量的 600 ～1000 倍。

2.3.3 反復(fù)給藥的毒性研究

2.3.3.1 rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予大鼠13 周的毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間沒(méi)有動(dòng)物意外死亡。100 和 1000 μg/kg 劑量組部分動(dòng)物出現(xiàn)脫毛或被毛稀疏，所有動(dòng)物未見(jiàn)其他與藥物毒性相關(guān)的異常臨床反應(yīng)。

各給藥組動(dòng)物的體重、食量、體溫、血液學(xué)、血液生化指標(biāo)、骨髓涂片、眼科檢查、T 淋巴細(xì)胞亞群分布、臟器重量和臟器系數(shù)等指標(biāo)未見(jiàn)有毒理學(xué)意義的規(guī)律性改變，給藥局部可見(jiàn)輕微或輕度的刺激性反應(yīng)，停藥后可恢復(fù)，其余組織臟器的組織病理學(xué)檢查也未見(jiàn)與藥物相關(guān)的改變。

抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥 2 周，動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生抗 rHSA/IFNα2a 和抗 IFNα2a 抗體，隨著給藥次數(shù)增加，抗體滴度呈升高趨勢(shì)，停藥 4 周后，抗體滴度明顯降低，抗體具有中和 rHSA/IFNα2a活性的作用。

表 4 rHSA/IFNα2a 與 rHSA/IFNα2b（Albuferon）的比較Table 4 Metabolism kinetic parameters comparison between rHSA/IFNα2a and rHSA/IFNα2b (Albuferon)

因此，在本試驗(yàn)條件下，rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予大鼠的基本安全劑量為 1000 μg/kg。

2.3.3.2 rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴13 周的毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間，150 和 500 μg/kg劑量組動(dòng)物在 2 次給藥后 WBC 明顯降低，首次和 2 次給藥后 Mono 明顯升高，50 和 150 μg/kg劑量組動(dòng)物在首次給藥后和 2 次給藥后 APPT 明顯延長(zhǎng)。各給藥組動(dòng)物的臨床觀察、體重、體溫、心電圖指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、骨髓涂片、尿常規(guī)、眼科檢查、T 淋巴細(xì)胞亞群分布、臟器重量及病理組織學(xué)檢查，均未見(jiàn)與藥物相關(guān)的有毒理學(xué)意義的明顯改變，給藥局部可見(jiàn)輕微或輕度的刺激性反應(yīng)，停藥后可恢復(fù)。rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴，可產(chǎn)生抗 rHSA/IFNα2a 和抗 IFNα2a的抗體，抗體具有中和 rHSA/IFNα2a 活性的作用。首次給藥后，rHSA/IFNα2a 的各劑量組試驗(yàn)結(jié)果基本呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)特征。多次給藥后由于中和抗體的產(chǎn)生，血漿中的抗原量低于檢測(cè)限。

因此，在本試驗(yàn)條件下，rHSA/IFNα2a 反復(fù)皮下注射給予食蟹猴的基本安全劑量為 500 μg/kg。中和性抗體屬于正?，F(xiàn)象，因?yàn)檠灏椎鞍自诋愒磩?dòng)物體內(nèi)較易產(chǎn)生特異性抗體。

2.3.4 rHSA/IFNα2a 的大鼠 II 段生殖毒性試驗(yàn) rHSA/IFNα2a 各劑量下孕鼠未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，給藥前后觀察注射局部未見(jiàn)異常；對(duì)孕鼠體重和食量均未見(jiàn)到明顯的影響，對(duì)胎仔未見(jiàn)明顯的毒性。各劑量組窩平均著床數(shù)、窩平均黃體數(shù)、窩平均活胎數(shù)、受孕率、活胎率、吸收胎率、死胎率、胎仔外觀畸形率、胎仔骨骼畸形率與生理鹽水對(duì)照組相比均未見(jiàn)明顯異常，胎仔內(nèi)臟未見(jiàn)畸形。

3 討論

3.1 研究項(xiàng)目選擇的依據(jù)

rHSA/IFNα2a 是重組融合蛋白，其分子結(jié)構(gòu)包含 HSA 和 IFNα2a 兩個(gè)部分，設(shè)計(jì)目的是希望保持 IFNα2a 的體內(nèi)和體外抗病毒生物學(xué)活性，并可維持血液中干擾素的藥物水平；為患者在長(zhǎng)達(dá)近12 個(gè)月的治療過(guò)程中，一直維持較高的血藥濃度、達(dá)到較高的依從度，獲得較好的治療效果，同時(shí)極大降低患者的費(fèi)用。在發(fā)揮長(zhǎng)效治療作用的同時(shí)，不帶來(lái)新的安全隱患。為評(píng)價(jià) rHSA/IFNα2a 是否達(dá)到上述研制目標(biāo)，我們開(kāi)展了藥理毒理動(dòng)物試驗(yàn)研究，試驗(yàn)選擇的考慮如下：①抗病毒作用和特點(diǎn)：體外抗乙肝病毒（HBV）試驗(yàn)考察 rHSA/IFNα2a 是否和 PEG-IFNα2a 一樣，具有相似的抗病毒作用，反應(yīng)出融合蛋白分子設(shè)計(jì)的合理性。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了本制品可以與 PEG 化的干擾素相類似的抗病毒生物學(xué)活性功能，表明與 HSA 融合蛋白與其他方式（如 PEG）修飾蛋白的長(zhǎng)效制劑一致。②長(zhǎng)效作用：按照生物制品研究的常規(guī)要求，分別開(kāi)展了在小鼠和大鼠（嚙齒類）中的代謝試驗(yàn)：吸收、分布和清除；在非人靈長(zhǎng)類（NHP）中的代謝試驗(yàn)：吸收、生物利用度和清除，并觀察了藥效動(dòng)力學(xué)。③安全性評(píng)價(jià)：按照法規(guī)要求和本制品的動(dòng)物敏感性特點(diǎn)開(kāi)展了系統(tǒng)的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，獲得安全劑量、毒性反應(yīng)特點(diǎn)、毒性靶器官的資料。

3.2 對(duì)研究結(jié)果的分析和評(píng)價(jià)

3.2.1 有效性評(píng)價(jià) ①抗病毒作用：試驗(yàn)結(jié)果顯示，rHSA/IFNα2a 在細(xì)胞模型和食蟹猴模型都顯示出顯著的抗病毒作用，且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，在食蟹猴的試驗(yàn)中量效關(guān)系也表現(xiàn)良好，表明rHSA/IFNα2a 具有和 PEG-IFNα2a 相似的生物學(xué)作用，在給藥 24 h 后出現(xiàn) 2-5oas 酶的明顯升高，起效快。②有效劑量：在食蟹猴試驗(yàn)中 10 μg/kg 顯示出顯著升高 2-5oas 酶活性的作用，達(dá)到和超過(guò)PEG-IFNα2a 的治療作用，也表明猴很敏感。③長(zhǎng)效特征：猴的藥效動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)顯示出明顯的長(zhǎng)效作用，給藥 1 次，可維持 2-5oas 酶活性水平第 14 天仍略高于模型組（最低點(diǎn)高于陰性對(duì)照組）。④作用時(shí)間：猴的藥效動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)顯示，較高的劑量可以使 2-5oas 酶活性提高，并滯后出峰（10 μg/kg 劑量組的出峰時(shí)間為第 24 小時(shí)；160 μg/kg 劑量組的出峰時(shí)間為第 144 小時(shí)），酶活性測(cè)定數(shù)值增加幅度很大。第 15 天（350 h）時(shí)各劑量組可檢測(cè)到的 2-5oas 酶活性要遠(yuǎn)高于給藥前的基數(shù)值。

3.2.2 對(duì) rHSA/IFNα2a 的綜合評(píng)價(jià)

臨床適應(yīng)證：臨床前研究結(jié)果顯示，rHSA/IFNα2a 顯示出與 rhIFNα 和 PEG 化 IFNα 相似的生物學(xué)作用，可以用于治療肝炎病毒引起的病毒病癥，以及其他 rhIFNα 的適應(yīng)證。

臨床用量：最敏感動(dòng)物猴的藥效試驗(yàn)顯示，10 μg/kg 顯示出顯著的療效，該劑量引起的抗病毒2-5oas 酶數(shù)值顯著升高，并在 14 d 以后仍高于藥前值。以該劑量為基礎(chǔ)，推算人用劑量為 600 μg/人次。因此，支持了本項(xiàng)目計(jì)劃的臨床試驗(yàn)起始劑量由 300 μg/人次開(kāi)始，這看來(lái)是安全和合理的爬坡起始劑量。

臨床用藥間隔：建議 14 d 給藥 1 次，理由如下：

⑴猴的藥效動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，14 d 給藥1 次，可以維持抗病毒和抗病毒復(fù)制的 2-5oas 酶活性水平高于模型組，并比每周用藥 1 次的陽(yáng)性對(duì)照派羅欣相比要持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間（約 2 倍）。

⑵大鼠和猴反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量的 rHSA/IFNα2a 可以被動(dòng)物體清除。因此，制品是安全的。在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì) rHSA/IFNα2a的中和抗體也是屬于十分正常的現(xiàn)象。因?yàn)楫愒吹难灏椎鞍自谶M(jìn)入受試體后會(huì)快速誘導(dǎo)產(chǎn)生具針對(duì)性的血清白蛋白的中和抗體。這些原因也使得進(jìn)行人體的臨床試驗(yàn)考察本制品的有效性和安全性顯得尤為必要。同時(shí)人源化血清白蛋白和干擾素較不易于在人體中產(chǎn)生明顯的針對(duì)性中和抗體。

⑶小鼠、大鼠和猴的生物反應(yīng)相似，提示在人體的持續(xù)時(shí)間可能相近。

考慮到 HSA 和 IFNα 都具有很強(qiáng)的種屬特異性，目前動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)的手段可能并不能真正暴露本制品的不良反應(yīng)，故作者將參照國(guó)外同類品種的臨床試驗(yàn)結(jié)果，在正在開(kāi)展的臨床試驗(yàn)研究中審慎關(guān)注本品的不良反應(yīng)?？傊白⑸溆弥亟M人血清白蛋白/干擾素 α2a 融合蛋白”新藥和作者已完成的“注射用重組人血清白蛋白/干擾素 α2b 融合蛋白”相同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，均在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了成藥性和長(zhǎng)效特征，總體安全性好，安全劑量范圍大，將為慢性病毒性肝炎患者的治療和防治提供新的選擇。

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