純化標(biāo)簽不同融合端的選擇對蝎毒肽色譜行為的影響

惠長野，邵建華，郭妍，張希，楊學(xué)琴，王佃鵬

蝎尾腺分泌的蝎毒具有極大的醫(yī)學(xué)價(jià)值，蝎毒的主要活性成分是一類由 28 ～ 76 個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽。按其分子的大小，可分為長鏈和短鏈兩大類。蝎毒素雖然空間結(jié)構(gòu)簡單，生理活性卻具有多樣性，因而一直是研究的熱點(diǎn)[1-2]。本實(shí)驗(yàn)以東亞鉗蝎抗癲癇肽（anti-epilepsy peptide，AEP，GI:37999913）為模型，在實(shí)現(xiàn) rAEP 原核可溶表達(dá)的基礎(chǔ)上，結(jié)合肽鏈構(gòu)象預(yù)測 His tag 在重組肽不同末端融合時(shí)的空間屏蔽效應(yīng)，并構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證。為類似活性多肽的重組表達(dá)提供借鑒，以滿足這類具有藥用潛質(zhì)的多肽的開發(fā)需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 表達(dá)載體及試劑 大腸桿菌 BL21（DE3）為本室保存；非融合表達(dá)質(zhì)粒 pTrx 為沈陽藥科大學(xué)生化教研室構(gòu)建[3]；Pyrobest DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 Nco I、EcoR I 及 T4 DNA 連接酶為日本 TaKaRa 公司產(chǎn)品；引物均由上海生工生物工程公司合成；LB 培養(yǎng)基成分購自英國 Oxoid 公司；金屬離子螯合柱 HisTrap FF為瑞典 Amersham 公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠（SPF 級），雄性，體重 20 ～ 25 g，購自沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：遼實(shí)合字 033 號。實(shí)驗(yàn)前，以顆粒狀基礎(chǔ)飼料飼喂 1 周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 AEP 生物信息學(xué)分析 Genbank 中搜索AEP 成熟肽同源序列并進(jìn)行比對分析，根據(jù) PDB庫中收錄的同源序列空間結(jié)構(gòu)，用 WHAT-IF 軟件對 AEP 進(jìn)行建模。

1.2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表達(dá)載體的構(gòu)建 以東亞鉗蝎尾腺 cDNA 庫為模板，根據(jù)Genbank 中 AEP 成熟肽序列設(shè)計(jì)引物見表 1。上游引物 P1 中，下劃線為 Nco I 酶切位點(diǎn)，6 個(gè)組氨酸編碼序列加粗顯示，下游引物 P2 帶有 EcoR I位點(diǎn)及終止密碼子，PCR 產(chǎn)物經(jīng) Nco I 及 EcoR I雙酶切，插入經(jīng)過同樣雙酶切的 pTrx 中構(gòu)建成純化標(biāo)簽 N端融合的表達(dá)載體 pTrx-His-AEP，編碼重組肽為 Met-Gly-His6-AEP，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄翻譯區(qū)見圖 1。純化標(biāo)簽 C 端融合的表達(dá)載體 pTrx-AEPHis 構(gòu)建方法同上，下游引物 P4 中引入 6 個(gè)組氨酸的編碼序列，編碼重組肽為 AEP-His6。

1.2.3 rAEP 的表達(dá)、純化 攜帶有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）接種至含卡那霉素 40 μg/ml 的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)至 OD600= 0.6，加入終濃度為 0.4 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng) 4 h 后，離心收集菌體，超聲破碎后的上清液上樣至用起始緩沖液平衡好的 HisTrap FF 柱。非變性條件下純化選用降低 pH 結(jié)合 NH4Cl 競爭洗脫，同時(shí)考察8 mol/L 尿素變性條件下的洗脫情況。

表 1 AEP 擴(kuò)增用引物Table 1 Primers used in this study

圖 1 重組質(zhì)?？寺?表達(dá)區(qū)Figure 1 pTrx-AEP cloning/expression region

1.2.4 rAEP 生物活性測定 采用硫代氨基脲致小鼠神經(jīng)興奮模型[4]。取體重 20 ～ 25 g 雄性昆明種小鼠 40 只，隨機(jī)分為 4 組，按 2.0 mg/kg皮下注射 rAEP，以等容生理鹽水為陰性對照、4.0 mg/kg 苯巴比妥鈉為陽性對照，于給藥 20 min后，腹腔注射硫代氨基脲 11.0 mg/kg，記錄 120 min內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物奔跑型轉(zhuǎn)至強(qiáng)直型驚厥發(fā)作潛伏時(shí)間，以相對陰性對照組的驚厥發(fā)作潛伏時(shí)間延長率為活性指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 AEP 序列分析及同源建模

AEP 與蝎毒素中昆蟲抑制性神經(jīng)毒素的同源性最高（圖 2）。Cys3 與 Cys6、Cys4 與 Cys7、Cys1 與 Cys8、Cys2 與 Cys5 配對成 4 個(gè)二硫鍵，在此基礎(chǔ)上形成一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域（knottin fold），該結(jié)構(gòu)對這類肽的生物活性和熱穩(wěn)定性都十分重要[5]。

AEP 建模的平面截圖見圖 3。AEP 空間結(jié)構(gòu)與大部分長鏈蝎神經(jīng)毒素相似，由一段 α 螺旋和三段反向平行的 β 片層構(gòu)成一個(gè)緊密的疏水核心，而 C 端為無規(guī)則卷曲，肽鏈相對比較延伸。

圖 2 AEP 與抑制性昆蟲毒素的序列比對分析Figure 2 Amino acid sequence comparison of AEP and depressant insect toxins

圖 3 AEP 的空間結(jié)構(gòu)及二硫鍵配對（紅色：α 螺旋；藍(lán)色：β 片層；綠色：β 轉(zhuǎn)角；黃色：二硫鍵）Figure 3 Three-dimension structure and disulfide bonds of AEP (Red: helix; Blue: beta strand; Green: bend; Yellow: disulfide bond)

2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表達(dá)載體的構(gòu)建

從空間結(jié)構(gòu)可以看出，AEP 的 N 端依次為βαββ 形成了一個(gè)緊密結(jié)構(gòu)（knottin fold），His tag融合于 N 端，容易被疏水核心所屏蔽。而 C 端肽鏈延伸出來，His tag 置于 C 端利于其與鎳離子結(jié)合。為此我們構(gòu)建了 His tag 不同末端融合的表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，在 250 bp 處出現(xiàn)目的條帶（圖 4A），測序分析顯示與預(yù)期相符。His tag體積小，并不影響 rAEP 的表達(dá)，不同末端融合的情況下，TrxA 和 rAEP 都得到高效可溶性表達(dá)，表達(dá)量相近（圖 4B）。

圖 4 重組質(zhì)粒 pTrx-AEP 的構(gòu)建Figure 4 Construction of recombinant plasmid pTrx-AEP

2.3 Met-Gly-His6-AEP 與 AEP-His6 純化結(jié)果對比

離心富集誘導(dǎo)后菌體，起始緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）重懸，超聲破碎后，高速離心（17800 × g，30 min，4 ℃）取上清。上樣至起始緩沖液平衡好的 HisTrap FF，再平衡至基線穩(wěn)定。改變 pH 洗脫，隨著 pH 的降低，His tag 與金屬離子螯合柱的結(jié)合能力降低，溶液洗脫能力增強(qiáng)。每次換用不同 pH 值溶液時(shí)，清洗至基線穩(wěn)定，且流出液 pH 恒定。pH 6.0 ～ 7.0 采用 25 mmol/L PBS 作為緩沖體系，pH 4.0 ～ 5.0 采用 25 mmol/L NaAc-HAc 緩沖體系。變性條件下的洗脫，為在各溶液體系中引入 8 mol/L 尿素。

2.3.1 Met-Gly-His6-AEP 純化結(jié)果 非變性條件下，各 pH 值緩沖液洗脫組分電泳分析結(jié)果見圖 5A。降低 pH 減弱 rAEP 與 HisTrap FF 的結(jié)合力，rAEP 電泳條帶在 6.5 kD 附近，少有菌體蛋白干擾?？梢?rAEP 在各洗脫峰中都存在，很難得到電泳純樣品。隨后洗脫液中引入了強(qiáng)變性劑8 mol/L 尿素，高濃度尿素的加入不破壞二硫鍵，但可以解除次級鍵對肽鏈構(gòu)象的約束，使肽鏈得到充分延伸，利于 His tag 的暴露。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 5B）也證實(shí)了這點(diǎn)，rAEP 與填料結(jié)合力增強(qiáng)，含有0.4 mol/L NH4Cl 的 pH 4.0 緩沖液洗脫峰達(dá)到了電泳純，但清洗除雜步驟還是伴隨有 rAEP 的損失，最終每升發(fā)酵液經(jīng)純化后獲得純度大于 95%樣品約為 0.8 mg。

圖 5 Met-Gly-His6-AEP 純化過程中收集組份的 17.5%Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 5 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of Met-Gly-His6-AEP

2.3.2 AEP-His6純化結(jié)果 根據(jù)空間結(jié)構(gòu)推測His tag C 端融合有利于其更好地暴露，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好地證明了這點(diǎn)，非變性條件下圖 6A，rAEP 在pH 降為 4.0 時(shí)都沒被洗脫，隨后加入 0.2 mol/L NH4Cl 才被洗脫，但純度不高。圖 6B 為 8 mol/L尿素存在下的洗脫結(jié)果，變性條件下 His tag 暴露更加充分，利于用更苛刻的條件除雜質(zhì)，0.4 mol/L NH4Cl 洗脫峰達(dá)到了電泳純。更重要的是洗滌步驟幾乎沒有 rAEP 的損失，每升發(fā)酵液經(jīng)純化后獲得純度大于 95% 樣品量提高為 3.3 mg。

圖 6 AEP-His6 純化過程中收集組份的 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE 分析Figure 6 17.5% Tris-Tricine SDS-PAGE for purification of AEP-His6

2.4 Met-Gly-His6-AEP 與 AEP-His6 抗小鼠神經(jīng)興奮活性

在硫代氨基脲致小鼠神經(jīng)興奮模型中，兩者均表現(xiàn)出抗神經(jīng)興奮作用（圖 7）。AEP-His6使小鼠驚厥大發(fā)作潛伏時(shí)間延長 47.7%，顯著高于 Met-Gly-His6-AEP 組（26.6%）及陽性對照藥苯巴比妥鈉組（28.4%）。推測與肽鏈 C 端延伸出 knottin fold 結(jié)構(gòu)域，His tag 對活性中心構(gòu)象影響小有關(guān)。

圖 7 rAEP 抗小鼠神經(jīng)興奮活性[結(jié)果以驚厥發(fā)作潛伏時(shí)間延長率±s 表示，AEP-His6 組延長率顯著高于 Met-Gly-His6-AEP 及苯巴比妥鈉組（*P ＜ 0.01）]Figure 7 Anti-neuroexcitatory activity of rAEP in mouse model. [The error bars represent the standard deviation of the mean, *P ＜ 0.01 by unpaired t test, significantly different from phenobarbital group. There was no statistically significant difference between Met-Gly-His6-AEP and phenobarbital groups (P ＞ 0.05)]

3 討論

AEP 與蝎昆蟲抑制性神經(jīng)毒素高度同源，它們都作用于 Na+通道，是 Na+通道抑制劑。這類長鏈蝎毒素大多由一個(gè)螺旋（極少數(shù)是兩個(gè)螺旋）、兩段或三段反向平行的 β 折疊組成一個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)核心，二硫鍵對核心結(jié)構(gòu)起著加固作用，親水殘基的側(cè)鏈暴露在溶液中，是分子具有不同特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5-6]。

在過量共表達(dá)硫氧還蛋白 TrxA 的情況下，營造胞質(zhì)內(nèi)氧化態(tài)勢利于二硫鍵的形成，AEP 這類富含二硫鍵的活性肽得到了可溶性表達(dá)[3,7]。蝎毒肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單及生物活性強(qiáng)的特點(diǎn)，這些毒素分子正在成為新藥開發(fā)及設(shè)計(jì)的模板。肽鏈末端極短肽段的去除對生物活性影響都很顯著，額外加入的肽段對空間結(jié)構(gòu)及活性中心結(jié)構(gòu)域的形成影響顯著[8]。重組表達(dá)時(shí)不宜選擇過大的融合標(biāo)簽，His tag 被廣泛用作小分子活性肽的親合標(biāo)簽。結(jié)合分子構(gòu)象，考慮 His tag 融合端的選擇對后序純化及生物活性的影響，對各類小分子活性肽的重組表達(dá)都具有借鑒意義。

[1] Rodríguez de la Vega RC, SchwartzZ EF, Possani LD. Mining on scorpion venom biodiversity. Toxicon, 2010, 56(7):1155-1161.

[2] Chippaux JP. Emerging options for the management of scorpion stings.Drug Des Devel Ther, 2012, 6:165-173.

[3] Shao JH, Hui CY, Cai QF, et al. The purification, gene clone and functional expression of scorpion anti-nociception peptide SAPIII.“Yiling Medicine Cup” 8th Nationol Youth Pharmacy Workers Academic Conference, 2006: 202-206. (in Chinese)

邵建華, 惠長野, 蔡啟峰, 等. 東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛活性肽SAPIII的分離純化、基因克隆與功能表達(dá)//“以嶺醫(yī)藥杯”第八屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集, 2006:202-206.

[4] Zhang JH, Hua ZC, Xu Z, et al. Expression of anti-neuroexcitation peptide (ANEP) of scorpion Buthus martensii Karsch in Escherichia coli. Prep Biochem Biotechnol, 2001, 31(1):49-57.

[5] Zhu J, Wang J, Cheng MS, et al. Dinucleotides docking to scorpion polypeptide toxins: a molecular modeling method for protein functional site recognition. Biochem Biophys Res Commun, 2009,378(2):157-161.

[6] Jung S, Dingley AJ, Augustin R, et al. Hydramacin-1, structure and antibacterial activity of a protein from the basal metazoan Hydra.J Biol Chem, 2009, 284(3):1896-1905.

[7] Stewart EJ, Aslund F, Beckwith J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm: an in vivo role reversal for the thioredoxins. EMBO J, 1998, 17(19):5543-5550.

[8] Possani LD, Becerril B, Delepierre M, et al. Scorpion toxins specific for Na+-channels. Eur J Biochem, 1999, 264(2):287-300.