直接電位法研究鉛離子與牛血清白蛋白的相互作用

江書慶，信建豪，竇運(yùn)修

（黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063）

鉛是一種嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，是出現(xiàn)在人類文明社會(huì)中最嚴(yán)重的環(huán)境污染物之一，它可以影響人類的各類器官，如神經(jīng)、造血、消化、泌尿、生殖、心血管、內(nèi)分泌、免疫、骨骼等［1］。鉛中毒問題既是一個(gè)古老的問題，又是一個(gè)探索不盡的新問題。進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)要通過血漿貯存與運(yùn)輸才能達(dá)到受體部位產(chǎn)生作用，而血清白蛋白可與許多內(nèi)源和外源性物質(zhì)結(jié)合以形成血清白蛋白的傳輸功能［2］。

牛血清白蛋白（BSA）是一種球蛋白，具有緊湊的橢圓結(jié)構(gòu)，其原始結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要來(lái)自疏水作用。它對(duì)大多數(shù)小型離子和分子具有很高的親合力，為了表征小離子或分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，通常研究小離子或分子與牛血清白蛋白的結(jié)合。研究小離子或小分子與牛血清白蛋白的結(jié)合的常用實(shí)驗(yàn)方法有直接分光光度法［3］、凝膠過濾方法［4］、熒光光度法［5］和平衡透析法［6］等。直接分光光度法和熒光光度法測(cè)定時(shí)誤差較大，而凝膠過濾法和平衡透析法測(cè)定的準(zhǔn)確度雖然較高，但是操作起來(lái)耗時(shí)太長(zhǎng)。直接電位法不受溶液的顏色、濁度等影響［7］，具有高選擇性、高準(zhǔn)確度、快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，用以研究小離子與BSA結(jié)合，具廣闊的應(yīng)用前景，但現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外研究較少［8］。

1946年Klotz等人在研究有機(jī)陽(yáng)離子如甲基橙、氮磺胺噻唑與BSA相互作用時(shí)，推導(dǎo)出Klotz方程［6］，方程形式如下：

其中，r為被BSA結(jié)合的離子的摩爾數(shù)與BSA的總摩爾數(shù)的比值，［L］為自由離子的平衡濃度，K為內(nèi)在分解常數(shù)，n為最大結(jié)合數(shù)。該方程用于直接電位法測(cè)定鉛離子與BSA的最大結(jié)合數(shù)和結(jié)合平衡常數(shù)，獲得較好的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

pHS－3CT型精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；PXSJ－216型離子活度計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）；鉛離子選擇性電極（上海電光器件廠）；217型雙接界甘汞電極（內(nèi)充0.1mol／L的KNO3溶液）；恒速磁力攪拌器（深圳天南海北有限公司）。牛血清白蛋白（BSA）（上海博世化學(xué)品有限公司，相對(duì)分子量：66，000）；pH5.0的醋酸緩沖溶液；Pb2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液：用Pb（NO3）2固體先配制成0.1mol／L的溶液，將該溶液逐級(jí)稀釋，并在稀釋過程中加入緩沖溶液和NaCl作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，使pH和離子強(qiáng)度恒定。得到一系列Pb2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。其它試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電極電位的測(cè)量方法

鉛離子選擇性電極使用之前先在1.0×10－3mol／L的Pb（NO3）2溶液中浸泡活化48h，用水沖洗后與217型甘汞電極組成測(cè)量電池，連接離子活度計(jì)，測(cè)量水的空白電位值，待其穩(wěn)定后即可測(cè)量試液。

1.2.2 Pb2＋與BSA相互作用分析

準(zhǔn)確稱取0.0660gBSA于7個(gè)10mL容量瓶中，分別加入1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL的10－2mol／L Pb（NO3）2標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別加入計(jì)算量的緩沖溶液和NaCl作為離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，使其pH值和離子強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同，并定容后搖勻。將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到25mL的燒杯中，在攪拌器上恒速攪拌10min后，用鉛離子選擇性電極和參比電極組成的測(cè)量電池測(cè)量其電位。

2 結(jié)果

2.1 電極Nernst響應(yīng)曲線

利用方法“1.2.1”依次測(cè)量該電極在1.0×10－7～1.0×10－2（mol／L）的Pb（NO3）2溶液中的電位值E，以電位E對(duì)Pb（NO3）2濃度（moL／L）的負(fù)對(duì)數(shù)pC作圖，見圖1。實(shí)驗(yàn)表明在Pb（NO3）2濃度為1.0×10－2～2.0×10－6moL／L范圍內(nèi)，E～pC具有良好的線性關(guān)系。在該濃度范圍內(nèi)用線性回歸計(jì)算出該曲線的線性方程為：E＝－61.13＋28.58pC，Nernst響應(yīng)斜率為28.58mV／pC，相關(guān)系數(shù)為0.9993。

2.2 結(jié)合位數(shù)與平衡常數(shù)的計(jì)算

圖1 鉛離子選擇性電極的Nernst響應(yīng)曲線

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定，測(cè)試液的pH和離子強(qiáng)度經(jīng)過精確調(diào)節(jié)，并用磁力攪拌器恒速攪拌，此時(shí)鉛離子選擇性電極所檢測(cè)信號(hào)的重現(xiàn)性良好，平均相對(duì)偏差不大于1.3%（n＝4）。

圖2 鉛離子與BSA相互作用

鉛離子與BSA的結(jié)合速度較快，使用鉛離子選擇性電極監(jiān)測(cè)鉛離子與BSA結(jié)合過程，實(shí)驗(yàn)表明10min后電位達(dá)到了恒定，證明10min后鉛離子與BSA結(jié)合達(dá)到了平衡。所以實(shí)驗(yàn)選擇10min作為相互作用時(shí)間。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

利用鉛離子選擇性電極測(cè)定溶液中其他組分的選擇性系數(shù)用以證明這些組分是否會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，實(shí)驗(yàn)表明，溶液中存在的各組分的選擇性系數(shù)均小于10－4。證明該體系無(wú)明顯干擾。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)［9］進(jìn)行比較，其結(jié)果出入較大。原因可能在于熒光分析中，雖然以靜態(tài)猝滅為主，但動(dòng)態(tài)猝滅可能同時(shí)存在，造成結(jié)果誤差。直接電位法檢測(cè)的是自由鉛離子的濃度，其他組分干擾較小，結(jié)果可能更加準(zhǔn)確。

［1］王蟹，徐輝碧，屠任覆，等.生命科學(xué)中的微量元素（下卷）［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1992：566－5881.

［2］ULRICH KH.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33（1）：17－53.

［3］OHYOSHI E，HAMADA Y，NAKATA K，KOHATA S.The interaction between human and bovine serum albumin and zinc studied by a competitive spectrophotometry［J］.Journal of Inorganic Biochemistry，1999，75（12）：213－218.

［4］YOUNG D A B，CIMASONI G.Gibbs－donnon and adsorption effects in the study of the binding of fluoride to albumin by gel filtration［J］.Biochemicaet Biophysica Acta，1974，342（15）：333－342.

［5］YAN WANG，YAN CHENG，HONG FANG SUN.Interaction of nicotine and bovine serum albumin［J］.Chinese Chemical Letters，2000，11（3）：247－250

［6］KLOTZ I M，WALKER，F(xiàn) M，PIVAN R B.The binding of organic ions by proteins［J］.Journal of American Chemical Society，1996，68（15）：486－1490.

［7］汪世花，馬軍霞.離子選擇電極示蹤技術(shù)及其應(yīng)用與展望［J］.勘察科學(xué)技術(shù)，2001，12（5）.

［8］EROL AYRANCI，OSMAN DUMAN.Binding of fluoride，Bromide and iodide to bovine serum albumin studied with ionselective electrodes［J］.Food Chemistry，2004，84（5）：539－543.

［9］吳根華，汪春華.熒光法研究Pb2＋與牛血清白蛋白的相互作用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2005，18（2）.