狂犬病毒的分子生物學研究進展

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(湖州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江湖州 313000)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(RV)引起的一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人獸共患傳染病，是全球病死率最高的急性傳染病之一，一旦感染發(fā)病，死亡率幾乎高達100%。

1 狂犬病毒的基因組結構

狂犬病病毒在分類學上屬單分子負鏈RNA 病毒目、彈狀病毒科、狂犬病毒屬，具有典型的子彈狀形態(tài)的包膜病毒，長170～180 nm，直徑75～80 nm，具有單股負鏈RNA基因組，有典型的基因組結構和基因表達方式，遺傳信息以超螺旋的核糖核蛋白復合體(RNP)形式儲存。

RV基因組全長約12 kb,相對分子質量約4.6×106，包括3′端的先導區(qū)、N、P、M、G、L 5個連續(xù)的結構基因及5′端的非翻譯區(qū)共七個部分。 5個結構基因的順序是3′-N-P-M-G-L-5′，該順序在RV中高度保守，分別編碼核蛋白、磷蛋白、基質蛋白、糖蛋白和轉錄大蛋白。各結構基因之間具有核苷酸數(shù)目不等的非轉錄間隔區(qū)。

2 影響狂犬病毒致病性的因素

2.1糖蛋白 編碼糖蛋白的G基因由1575個核苷酸組成。依據(jù)功能不同，分為4個區(qū)：1～57位核苷酸為信號肽編碼區(qū)，58～1374位核苷酸為膜外區(qū)編碼區(qū)，1375～1440位核苷酸為跨膜區(qū)編碼區(qū)，1441～1575位核苷酸為膜內區(qū)編碼區(qū)。G基因只有一個開放讀碼框(ORF)，編碼524個氨基酸糖蛋白前體。

病毒粒子表面的糖蛋白是狂犬病毒嗜神經(jīng)性的主要決定物質，糖蛋白能與存在于神經(jīng)細胞表面的細胞受體發(fā)生特異性結合反應，從而決定了狂犬病毒的神經(jīng)嗜性。據(jù)Gastka M等(1996)[1]報道，研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)肌肉連接處能檢測到核糖核蛋白(RNP)，糖蛋白的189～214位氨基酸序列與蛇神經(jīng)毒素的氨基酸序列有很高的同源性，銀環(huán)蛇毒素或D-筒毒素能阻斷狂犬病毒結合到肌管上。動物實驗表明，動物對狂犬病毒的易感性與肌肉組織中煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)的含量密切相關，被認為是與狂犬病毒糖蛋白結合的受體。除nAChR外，磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、神經(jīng)細胞粘附分子及神經(jīng)生長因子等也可能是狂犬病毒的受體，Thoulouze等(1998)[2]證實，神經(jīng)細胞粘附因子(NCAM)是狂犬病毒糖蛋白的受體，無NCAM 的細胞轉染了NCAM基因后對狂犬病毒的易感性明顯提高，用可降解NCAM 的試劑先行孵育細胞，則狂犬病毒不易感染細胞。另外，天然的狂犬病毒糖蛋白可以與p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)結合，感染神經(jīng)細胞[3]。由于這些受體表達于神經(jīng)細胞表面，因此糖蛋白與這些受體結合使病毒固定在細胞上，之后以胞飲方式進入細胞，在糖蛋白的作用下使病毒膜與溶酶體液泡融合，把RNP釋放到細胞質中，通過這種途徑?jīng)Q定了狂犬病毒的神經(jīng)嗜性。

糖蛋白的結構與病毒毒力有著密切關系。研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒糖蛋白膜外區(qū)330位的賴氨酸和333位的精氨酸分別被天門冬氨酸和甲硫丁氨酸取代可明顯降低G和神經(jīng)瘤細胞之間的相互作用，形成的雙突變狂犬病毒株對成年小鼠無致病性[4]。據(jù)Dietzschold B(1983)[5]研究發(fā)現(xiàn)，當糖蛋白氨基酸序列的第333位精氨酸被異亮氨酸、谷酰胺、谷氨酸或甘氨酸替換，不論以何種劑量、何種途徑用狂犬病毒感染小鼠，均無致病性，這是由于這種突變可以阻止運動神經(jīng)元的感染和病毒在成神經(jīng)瘤細胞培養(yǎng)中的傳播。但值得注意的是不是所有333位的氨基酸突變都能降低病毒株的毒力，Tuffereau等發(fā)現(xiàn)用333位氨基酸突變株免疫1～2日齡乳鼠，則可引起乳鼠發(fā)病[6]。糖蛋白的第164～303位氨基酸與狂犬病毒對成年鼠的致死性作用有關，其中第242、255、268位氨基酸能增強狂犬病毒的毒力。Takayama-Ito M等(2006)[7]研究發(fā)現(xiàn)，無致病性毒株第194位的天冬酰胺若被賴氨酸替換，則能增強狂犬病毒突變株的毒力，使病毒對宿主的致病性能力提高。

作為狂犬病毒中唯一的糖基化蛋白，糖蛋白的糖基化與病毒毒力及致病性密切相關。糖基化決定其穩(wěn)定性、抗原性及生物學活性，在糖蛋白的表達與分泌中起著關鍵的作用。每個糖蛋白分子上有3～4個糖基化位點，不同毒株糖基化的數(shù)量和位置不完全相同，但319位點存在于目前所有測序的糖蛋白上，此位點關系著糖蛋白的正確折疊和加工運輸?；颌裥偷亩鄶?shù)毒株37位可被糖基化，另外158、247、319等處也是Ⅰ型病毒潛在的糖基化位點，其它型病毒的糖蛋白則分別在202、319(Mokola)、247(Duvenhage)、184、202、334(Lagos bat)出現(xiàn)多處潛在的糖基化位點[8、9]。Buger將感染RV的細胞用一種能阻斷糖基化的突尼卡霉素處理后，完全阻斷了糖蛋白在細胞膜上的表達，進而影響狂犬病毒的毒力[10]。

2.2細胞凋亡 糖蛋白與宿主神經(jīng)細胞凋亡有關?，F(xiàn)有研究表明，病毒株的致病性與誘導細胞凋亡的能力成反比。Jackson等(1997)[11]證實，有致病性的狂犬病毒侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)后能誘導神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，說明細胞凋亡與病毒的致病機理有一定的關系。據(jù)Pulmanausahakul R等(2001)[12]研究發(fā)現(xiàn)，表達細胞色素C的重組狂犬病毒，通過外周途徑感染小鼠，發(fā)現(xiàn)病毒致病性明顯降低，這是因進入細胞漿的細胞色素C在dATP 存在的條件下能與凋亡相關因子1(Apaf-1)結合，使其形成多聚體，促使半胱天冬蛋白酶9(caspase-9)與其結合形成凋亡小體，caspase-9 被激活，被激活的caspase-9 能激活其它caspase，如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡。單獨表達狂犬病毒糖蛋白就能充分誘導細胞凋亡，Prehaud等(2003)[13]研究表明，克隆狂犬病毒G 基因的重組體在誘導表達系統(tǒng)的幫助下能誘導細胞凋亡，且發(fā)現(xiàn)來源于ERA減毒株的G 基因較來源于CVS攻擊毒株的G 基因更容易誘導細胞發(fā)生半胱天冬蛋白酶依賴的細胞凋亡。另外，狂犬病毒減毒株能誘導涉及凋亡誘導因子AIF 的不依賴半胱天冬蛋白酶的細胞凋亡。以上兩種細胞凋亡途徑可被Bcl-2 基因的過度表達所抑制，表明Bcl-2 基因的增量調節(jié)對感染細胞中的病毒具有保護作用，這是因為Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽(GSH)的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性，抑制細胞凋亡。因此，由于細胞的凋亡,限制了病毒的感染。

3 狂犬病毒的繁殖過程

狂犬病毒糖蛋白與細胞受體結合后進入細胞，在糖蛋白的作用下，把核衣殼釋放到細胞質中，病毒在細胞質中進行轉錄、翻譯、復制，然后組裝成新的病毒粒子，完成病毒的繁殖過程。

彈狀病毒mRNA 的轉錄是從基因組3′端啟動子處發(fā)生的，連續(xù)合成單順反子mRNA，RNA 聚合酶在每個基因的邊界都會發(fā)生部分的解離，使得從3′端到5′端基因的轉錄產(chǎn)物越來越少，形成一個轉錄梯度?？袢《?個基因間隔區(qū)的核苷酸數(shù)目不一樣，使得越靠近5′端的基因受間隔區(qū)的影響越大，尤其是L 基因，其轉錄產(chǎn)物幾乎不能被檢測到。Finke S等(2000)[14]發(fā)現(xiàn)，當用P-M、M-G、G-L之間的間隔區(qū)核苷酸替換N-P之間的核苷酸，下游基因的轉錄產(chǎn)物分別下降22%、19%、89%，證明了基因間隔區(qū)對基因轉錄的調控作用，間隔區(qū)越長，下游基因轉錄越少。相反，當用N-P基因之間的間隔區(qū)序列替換G-L基因之間的序列，發(fā)現(xiàn)L 基因的mRNA 的表達量和病毒RNA 的合成都普遍增加。表明狂犬病毒演化了一套獨特的調節(jié)轉錄機制來影響病毒的復制能力。

狂犬病毒mRNA 是以細胞的翻譯機制被翻譯,大部分在細胞質中游離的多核糖體中表達。但是，G 蛋白是在粗面內質網(wǎng)中翻譯產(chǎn)生，再經(jīng)過高爾基體被轉運到細胞膜上。狂犬病毒基因組的復制是以核糖核蛋白復合體作為模板，復制是在協(xié)調因子P 蛋白的參與下，由病毒RNA 依賴的RNA 聚合酶催化完成的。

值得注意的是，M 蛋白對病毒的轉錄復制也具有重要的調控作用。據(jù)Finke S等(2001)[15]研究發(fā)現(xiàn)，當缺少M 蛋白時，狂犬病毒的復制受到限制，基因轉錄效率提高，轉錄產(chǎn)物增加；當增加M 蛋白時，轉錄效率下降，復制增加。

4 狂犬病毒載體的研究進展

據(jù)Inoue K等(2003)[16]研究發(fā)現(xiàn)，狂犬病毒在宿主體內能誘導產(chǎn)生高效的體液免疫和細胞免疫，故狂犬病毒作為載體在疫苗制備方面具有廣泛的用途?？袢《据d體在保留糖蛋白作為主要的保護性抗原的同時，關鍵是要避免病毒本身的神經(jīng)致病性。目前降低病毒致病性的常用途徑有兩種：一是對糖蛋白主要抗原位點的氨基酸突變來降低病毒的毒力；二是通過反向遺傳學技術拯救病毒。到目前為止，已經(jīng)拯救了3株狂犬病毒弱毒株，分別為SAD B19、HEP-Flury 和RC-HL。

目前用作載體的狂犬病毒多為SAD B19弱毒株。用該載體表達艾滋病、丙型肝炎等病毒抗原的實驗研究都取得了很好的效果。最近，Smith ME等(2006)[17]用狂犬病毒糖蛋白作為轉移載體表達炭疽保護性抗原，免疫小鼠有一定的保護效果。狂犬病毒的高治病性，使狂犬病毒載體的使用受到質疑。但是，因為病毒在人體內的血清陽性率較低，故狂犬病毒作為載體具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

狂犬病是全球性的嚴重公共衛(wèi)生問題，全世界估計每年有數(shù)萬人死于該病，故對狂犬病毒的研究顯得尤為重要。對病毒致病性及繁殖過程中關鍵步驟分子機理的深入研究，有助于狂犬病毒高度弱毒株和狂犬病毒載體的合理設計，而且對研究治療狂犬病毒或其他負鏈RNA 病毒的特異性抗病毒藥物具有很大的幫助。

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