骨髓間充質干細胞的免疫學特性及其同種異體的應用研究進展

武京國 綜述 曹誼林 肖苒 審校

BMSCs是一類存在于骨髓基質中的成體干細胞，參與骨髓微環(huán)境的形成，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化的潛能。由于BMSCs沒有特異性表面抗原標志分子，因此通常以細胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105等陽性標志，以及CD34、CD45等陰性標志作為鑒別指標。目前，分離BMSCs的方法有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和磁珠分離法等。自體BMSCs的數(shù)量和功能受年齡、疾病等因素的影響[1]，體外擴增時間長。因此，Allo-BMSCs更符合臨床應用的要求。本文就BMSCs的免疫學特性及其同種異體的應用研究進展進行綜述。

1 BMSCs的免疫學特性

1.1 BMSCs的低免疫原性

多數(shù)研究認為，BMSCs高表達MHCⅠ類分子，不表達MHCⅡ類分子，低表達共刺激分子B7-1（CD80），不表達B7-2（CD86）。MHCⅠ類分子與NK細胞表達的殺傷抑制受體（KLR）結合，使NK細胞對異體或腫瘤細胞的殺傷作用下調(diào)，從而保護BMSCs免受NK細胞的殺傷。此外，BMSCs不表達Fas配基和多種共刺激分子，可能會引起T淋巴細胞無能，誘導免疫耐受。然而Le Blance等[2]通過Western blotting的方法，在BMSCs全細胞裂解物中檢測到了MHCⅡ類抗原的存在，用IFN-γ刺激BMSCs也會使 90%以上的細胞表達MHCⅡ類抗原，而有無 IFN-γ刺激，BMSCs均不會引起T細胞增殖。Potian等[3]也發(fā)現(xiàn)BMSCs既表達MHCⅠ類抗原也表達MHCⅡ類抗原，但沒有明顯的免疫原性，且對免疫反應有抑制作用。這些研究提示，MHC的表達可能不是導致BMSCs免疫豁免的主要因素。Tse等[4]發(fā)現(xiàn)，共刺激分子B7-1或B7-2基因轉染的BMSCs仍不能引起T細胞的增殖活化，也不支持BMSCs是由于缺乏共刺激分子而導致T淋巴細胞增殖受抑制。

Chan等[5]卻發(fā)現(xiàn)BMSCs在一定條件下可能作為抗原提呈細胞（APC），引發(fā)受體的免疫排斥反應。Nauta等[6]認為BMSC能夠誘導機體記憶性T細胞激活，并針對移植物發(fā)生免疫排斥，減少移植物的存活時間?？傊珺MSCs可能不是完全免疫豁免的，因此需要進一步研究BMSCs可能誘發(fā)免疫反應的相關因素，了解同種異體BMSCs與免疫系統(tǒng)的相互作用，確保將來臨床應用的安全性。

1.2 BMSCs與同種異體免疫系統(tǒng)的相互作用

機體的免疫應答包括固有免疫（Innate immunity）和適應性免疫（Adaptive immunity）。固有免疫對外來侵入的病原體迅速應答，同時在適應性免疫的啟動、調(diào)節(jié)和效應階段也起重要作用。適應性免疫分為細胞免疫和體液免疫。T細胞是細胞免疫的主要效應細胞，包括細胞毒性T細胞（Cytotoxic T cells，Tc）、輔助性 T 細胞（Helper T cells，Th）和抑制性 T 細胞（Suppressor T cells，Ts）。負責體液免疫的是B細胞，產(chǎn)生與相應抗原發(fā)生特異性結合反應的抗體。

1.2.1 BMSCs與固有免疫

BMSCs表達 CD55、CD46和 CD59，分泌 Facor H，從而通過補體系統(tǒng)避免機體發(fā)生超急性和急性免疫排斥反應。然而，BMSCs并非與固有免疫沒有任何聯(lián)系，Schraufstatter等[7]發(fā)現(xiàn)補體C3a和C5a能夠趨化BMSCs到達組織損傷部位。體外研究也發(fā)現(xiàn)，BMSCs通過釋放前列腺素E2（PE2）和吲哚胺雙加氧酶（IDO）抑制NK細胞的增殖活化。BMSCs還能夠抑制靜息或活化狀態(tài)下中性粒細胞的凋亡，從而維持其吞噬和趨化功能。這些研究表明，BMSCs能夠以某種特定的方式調(diào)節(jié)固有免疫，從而避免炎癥和免疫反應的發(fā)生。

1.2.2 BMSCs與細胞免疫

樹突狀細胞（DC）作為CD4+Th細胞的抗原提呈細胞在適應性免疫中發(fā)揮著關鍵作用，BMSCs能夠從多方面調(diào)節(jié)DC的生物學活性。BMSCs和DC前體細胞共同存在于骨髓基質中，抑制單核細胞向DC前體細胞分化。BMSCs抑制DC向CD4+Th細胞提呈抗原，抑制DC表達鈣黏素，降低其趨化作用。通過BMSCs的調(diào)節(jié)，DC分泌IL-12減少，而IL-10的分泌增加，從而通過誘導調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）間接介導免疫耐受[8]。

BMSCs可調(diào)節(jié)T淋巴細胞分化。Batten等[9]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs分泌多種細胞因子，使Th1細胞數(shù)量減少，Th2細胞數(shù)量增加，還能通過抑制細胞因子IL-17、IL-22、IFN-γ和TNF-α的表達，阻止CD4+T淋巴細胞向Th1細胞方向分化，而且在炎癥環(huán)境中，通過CCR6介導Th1細胞的黏附，誘導Treg發(fā)揮抗炎作用。因此，BMSCs具有直接抑制效應性CD4+T淋巴細胞和激活并維持Treg的潛能。

1.2.3 BMSCs與體液免疫

目前關于BMSCs與B細胞以及抗體產(chǎn)生的關系還存在爭議。Rafei等[10]發(fā)現(xiàn)，BMSCs能抑制B細胞增殖和免疫球蛋白的產(chǎn)生，這些作用是通過CCL12、INF-γ以及PD1/PDL1實現(xiàn)的。Rasmusson等[11]卻發(fā)現(xiàn)BMSCs分泌的細胞因子能活化B細胞或漿細胞。因此，BMSCs和B細胞、漿細胞之間可能存在著復雜的聯(lián)系，究竟BMSCs是抑制抗體的產(chǎn)生利于臨床應用還是激活B細胞分泌抗體而限制其應用，還需進一步研究。

1.3 BMSCs在同種異體內(nèi)的免疫豁免程度

關于BMSCs在同種異體內(nèi)的免疫原性目前還存在爭議。Chen等[12]認為，BMSCs在自體和同種異體內(nèi)均無免疫反應；而Isakova等[13]在對MHC錯配的恒河猴進行顱內(nèi)BMSCs注射時卻發(fā)現(xiàn)，外周血淋巴細胞亞群發(fā)生了改變，MSCs的免疫原性呈劑量依賴性。Rafei等[14]用allo-BMSCs對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠進行靜脈注射，雖然發(fā)生了T淋巴細胞反應，但BMSCs仍有治療作用，提示BMSCs的免疫原性和它所發(fā)揮的生物學作用可以共存。此外，BMSCs植入部位也是影響其免疫原性的重要因素，植入顱骨、大腦、關節(jié)腔等部位細胞表現(xiàn)出低免疫原性，而靜脈、腹腔、皮下和心肌注射易引發(fā)機體免疫反應。

BMSCs在同種異體內(nèi)是否完全免疫豁免，或者能夠在多大程度上逃避免疫排斥反應，以及需在體內(nèi)存活多長時間才能發(fā)揮它的最大作用，能否達到自體BMSCs所發(fā)揮的作用，目前還不是很明確。體內(nèi)短時間存在的BMSCs可能會發(fā)揮一定的生物學作用，但BMSCs的長期存活以及移植數(shù)量多少是否會因免疫反應而發(fā)生生物學作用的改變，BMSCs的免疫原性和它所發(fā)揮的生物學作用是否可以共存，還有待于深入研究。

2 Allo-BMSCs在動物實驗研究中的應用

大量研究表明，BMSCs在同種異體內(nèi)具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，從而使干細胞移植避免了同種異體MHC配型的局限性，而且BMSCs移植后具有定向分化和旁分泌功能。目前，Allo-BMSCs在動物實驗研究中的應用包括促進組織再生、組織工程化組織構建、受體免疫調(diào)節(jié)等方面。

2.1 Allo-BMSCs在再生醫(yī)學和組織工程中的應用

2.1.1 細胞治療應用研究

Makkar等[15]通過結扎冠狀動脈的方法建立動物心肌梗死模型，應用Allo-BMSCs移植，結果顯示在沒有使用免疫抑制劑的情況下受體未發(fā)生免疫排斥，而且BMSCs在梗死部位存活并分化為終末的心肌細胞，使心功能得到了明顯的改善。Imanishi等[16]發(fā)現(xiàn)心肌注射Allo-BMSCs對急性心肌梗塞（AMI）大鼠有效，BMSCs促進了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的分泌，同時無免疫反應發(fā)生。有研究認為，BMSCs移植后通過血腦屏障，能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs）發(fā)揮營養(yǎng)支持作用，由于外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs）不能通過血腦屏障，因此將BMSCs注射到動物腦缺血部位，能夠促進局部組織血管化和神經(jīng)功能的恢復[17]。Togel等[18]應用BMSCs治療急性腎缺血再灌注損傷時發(fā)現(xiàn)，自體細胞移植效果優(yōu)于異體細胞移植。因此，Allo-BMSCs在細胞治療中的作用還需更多研究。

2.1.2 Allo-BMSCs在組織工程中的應用

BMSCs作為種子細胞已廣泛應用于組織工程化組織和器官的構建，而Allo-BMSCs復合生物材料移植入體內(nèi)后的免疫原性如何，復合物能否成功構建組織和修復缺損，大量動物實驗在骨和軟骨領域中開展。Djouad等[19]將攜帶BMP基因的BMSCs注射到同種異體小鼠的關節(jié)腔和肌肉間隙中，發(fā)現(xiàn)雖然有淋巴細胞浸潤，但細胞能夠在異位成骨。Roberta等[20]用Allo-BMSCs復合羥基磷灰石（HA）植入小鼠皮下，卻引起了機體的免疫排斥反應，沒有形成新生骨組織。Akahane等[21]在使用免疫抑制劑FK506的情況下，將Allo-BMSCs和HA復合物植入大鼠皮下形成了新生骨組織；Tsuchida等[22]也在使用FK506的情況下，利用同種異體組織工程骨修復了大鼠股骨缺損。但是，免疫抑制劑可能導致嚴重的毒副作用。Arinzeh等[23]在應用同種異體組織工程骨修復犬股骨缺損的實驗研究中，沒有任何免疫防治措施干預，卻能夠完成骨缺損的修復，也沒有發(fā)生免疫排斥反應，組織學觀察無淋巴細胞浸潤，受體血清中也沒有檢測到同種抗體。Guo等[24]發(fā)現(xiàn)自體或異體BMSCs構建的組織工程骨在修復豬的脛骨缺損中，雖然早期存在一定的炎癥或免疫反應，但不影響新骨的形成和缺損的修復。

在同種異體組織工程軟骨構建和缺損修復方面，Pei等[25]應用兔關節(jié)滑膜來源的BMSCs，復合PGA支架，成功修復了同種異體的膝關節(jié)全層軟骨缺損，沒有發(fā)生免疫排斥。而Acosta等[26]通過Allo-BMSCs-材料復合物移植修復豬的椎間盤時在缺損部位，卻沒有發(fā)現(xiàn)存活的BMSCs，缺損最終瘢痕愈合。動物種屬不同，細胞-材料復合物植入部位不同，Allo-BMSCs作為組織工程的種子細胞發(fā)生免疫反應的程度和修復效果存在很大差異，真正進入臨床應用還有待深入研究和更多大動物實驗。

2.2 Allo-BMSCs調(diào)節(jié)機體免疫

2.2.1 BMSCs在同種異體組織移植中的免疫抑制作用

2002年，Bartholomew等[27]在進行動物同種異體皮膚移植時，同時對受體輸入Allo-BMSCs，延長了移植皮膚的存活時間，提示BMSCs可能具有抑制組織移植免疫排斥的作用。Allo-BMSCs能降低同種異基因造血干細胞移植（HSCT）過程中移植物抗宿主?。℅vHD）的發(fā)生率。Polchert等[28]發(fā)現(xiàn)IFN-γ活化的BMSCs能顯著抑制T淋巴細胞增殖，從而降低GvHD的發(fā)生率。HSCT聯(lián)合BMSCs移植還能促進造血干細胞（HSCs）歸巢和增殖，提高移植效率，縮短因大劑量化療導致骨髓抑制的時間，盡快恢復自主造血。

2.2.2 Allo-BMSCs在自身免疫性疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用

Ⅰ型糖尿病時胰島細胞移植是治療手段之一，同時聯(lián)合Allo-BMSCs移植可誘導免疫耐受，延長移植胰島細胞存活時間和保護其分泌胰島素功能[29]。Schena等[30]發(fā)現(xiàn)，Allo-BMSCs能夠通過抑制IFN-γ依賴性B淋巴細胞增殖，保護因系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）造成的腎臟損害。自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是由T細胞介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，Rafei等[14]同樣發(fā)現(xiàn)Allo-BMSCs對EAE有效。目前認為，再生障礙性貧血（AA）同樣由免疫因素介導，Allo-BMSCs可能通過影響T細胞亞群分化改善AA癥狀。

3 Allo-BMSCs的臨床應用及存在的問題

3.1 Allo-BMSCs臨床應用個案報道

由于目前沒有制定Allo-BMSCs的應用標準，細胞在體內(nèi)的免疫反應、轉歸以及安全性問題還需研究，因此臨床應用僅限于個案報道。Tateishi-Yuyama等[31]對下肢動脈缺血性疾病患者局部注射Allo-BMSCs，踝臂指數(shù)（ABI）得到了顯著性提高。嚴重的兒童成骨不全患者移植Allo-BMSCs后，發(fā)現(xiàn)能表達正常膠原。Fouillard等[32]將Allo-BMSCs輸入接受自體骨髓移植（ABMT）治療的白血病患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSCs能改善機體造血功能，無GvHD的發(fā)生。部分大劑量化療后、SLE和AA進行HSCT或胰島移植過程中，同時輸入Allo-BMSCs，具有協(xié)同作用，患者臨床癥狀得到了改善[33,34]。糖尿病患者采用胰島細胞聯(lián)合Allo-BMSCs移植治療也取得了不錯的效果。郭可泉等[35]通過HLA不相合的骨髓干細胞移植誘導心臟移植后，受者特異性免疫耐受，有效建立嵌合體，但遠期效果有待繼續(xù)觀察。組織工程骨和軟骨進入臨床大都采用自體BMSCs[36]，未見Allo-BMSCs的相關報道。

3.2 Allo-BMSCs臨床應用存在的諸多問題

Allo-BMSCs的研究廣泛處于臨床前期，還有許多問題有待解決：①細胞的來源、純化、體外增殖分化、儲存運輸以及安全性檢測等，目前國際上還沒有明確統(tǒng)一的標準，尤其是對細胞進行基因修飾，可能存在疾病傳播的風險；②生產(chǎn)過程中可能存在的外來污染、培養(yǎng)液帶來的生物源性因素等問題，目前也沒有指導性建議；③部分患者可能對產(chǎn)品存在過敏、同種抗體免疫排斥等不良反應，如何應對副作用的發(fā)生；④細胞植入體內(nèi)的長期轉歸，最終能否與機體整合，并進行正常的營養(yǎng)代謝等生理活動，有無致瘤性、疾病傳染等安全問題，還需要大量動物實驗和臨床前期的長期觀察，以期能提供理論和應用依據(jù)[37]。

4 前景和展望

同種異體BMSCs作用的免疫環(huán)境是動態(tài)的、復雜的，因此能否在臨床中產(chǎn)生良好的預期效果，還需要進一步的動物實驗和臨床前期實驗證實。另外，最近有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs長期培養(yǎng)后具有惡變潛質，也可能會因對機體的免疫抑制作用而促進腫瘤的形成和生長[38]，所以在進行臨床實驗前需要對其安全性進行慎重檢測和評估。

隨著大量動物實驗和臨床實驗的開展，Allo-BMSCs的性質、作用會進一步被闡明，體外分離和培養(yǎng)方法會逐步改進，安全性評估也會確立，相信在不久的將來，Allo-BMSCs將會廣泛應用于臨床。

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