Gefitinib獲得性耐藥產生時非小細胞肺癌上皮性標志EGFR及E-cadherin表達的變化

趙寶霞，田麗敏，竇 薇，呂海辰，李 梅，呂 申

(1. 大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 實驗中心，遼寧 大連 116027； 2. 大連醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院， 遼寧 大連 116044； 3. 復旦大學上海醫(yī)學院 臨床醫(yī)學(8年制)，上海 200032)

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居各種癌癥之首。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%以上，目前手術切除是對其治療最有效的方法。然而，多數(shù)患者在腫瘤發(fā)現(xiàn)時已處于臨床晚期，失去了手術時機，另外即使接受了外科治療的患者也常需要化療輔助。因此，化療仍是目前臨床治療NSCLC應用最廣的手段。然而，傳統(tǒng)化療藥物因其特異性差、毒副作用大在臨床應用中受到很大的限制。近年來，以表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)為靶點的腫瘤分子靶向治療在晚期NSCLC應用中療效顯著，其中應用最廣的藥物是gefitinib和erlotinib。研究表明對EGFR-TKI敏感的NSCLC常有EGFR18、19、21位外顯子突變，而這些突變多見于亞裔、女性、非吸煙患者的腺癌。值得注意的是，隨著EGFR-TKI臨床應用的拓展和時間的推延，一些原本對該藥敏感的NSCLC會產生獲得性耐藥，而獲得性耐藥是用該藥治療失敗的主要原因。探討NSCLC中 EGFR-TKI獲得性耐藥的發(fā)生機制已成為該藥臨床應用中亟待解決的問題。

文獻報道，有EGFR突變的NSCLC常會高表達EGFR和E-cadherin，多數(shù)高表達EGFR和E-cadherin的NSCLC對EGFR-TKI敏感[1-2]。那么，當NSCLC患者對EGFR-TKI產生耐藥性時其攜帶的腫瘤是否會有EGFR和E-cadherin蛋白表達的變化？本研究采用逐步遞增藥物濃度、間歇作用體外誘導法誘導人肺癌細胞株NCI-H1975，建立了gefitinib獲得性耐藥細胞株——人肺癌細胞株NCI-H1975/GR，比較獲得性耐藥細胞株與親本株細胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達變化，希望能為探討NSCLC的EGFR-TKI獲得性耐藥產生機制提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細胞株：人肺腺癌細胞株NCI-H1975，購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所，國家中醫(yī)藥管理局大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院分子生物學實驗室保存。

主要試劑：gefitinib(Selleck公司，美國)、鼠抗人 EGFR單克隆抗體(克隆號111.6， NeoMarkers，美國)及鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人肺癌細胞株NCI-H1975的培養(yǎng)：用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)細胞株NCI-H1975，每隔3～4 d消化、傳代1次。培養(yǎng)細胞呈單層貼壁生長。

1.2.2 Gefitinib獲得性耐藥細胞株NCI-H1975/GR的建立：采用逐步遞增gefitinib濃度、間歇作用體外誘導法誘導NCI-H1975細胞耐藥。Gefitinib以起始濃度12 μmol/L作用于對數(shù)生長期的細胞，24 h后棄去含藥培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待其恢復正常生長，消化傳代后復用相同濃度的gefitinib作用24 h，如此每一濃度反復兩次，藥物濃度遞增，反復換液傳代，歷時6個月獲得了能夠在含gefitinib濃度80 μmol/L培養(yǎng)基中良好生長的耐藥細胞株(命名為NCI-H1975/gefitinib resistance，簡寫為NCI-H1975/GR)。

1.2.3 形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡下直接觀察存活狀態(tài)的NCI-H1975與NCI-H1975/GR的細胞形態(tài)，特別是加入gefitinib后二者的細胞狀態(tài)變化。

1.2.4 生長曲線測定：將濃度為1×104/mL 的NCI-H1975和NCI-H1975/GR的細胞懸液接種于24孔板中，每孔1.5 mL。每24 h計數(shù)其中3孔的細胞數(shù)，取平均值，連續(xù)7 d。以時間天數(shù)為橫坐標，以每天的細胞數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線。 按照公式 T=tlg2/lgNt-lgN0計算細胞的倍增時間(其中T為群體倍增時間，t為連續(xù)培養(yǎng)時間，Nt為終末細胞數(shù)，N0為初始細胞數(shù)，單位為小時)。

1.2.5 NCI-H1975及NCI-H1975/GR細胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達檢測：細胞爬片生長后，用冷丙酮固定細胞15 min，采用SP法進行免疫細胞化學染色，DAB法顯色，蘇木素復染，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.6 判斷標準：(1)EGFR蛋白表達的判斷標準：以細胞膜或細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性表達，分別記錄表達部位，其表達強弱與親本細胞株的相應表達部位比較。(2)E-cadherin蛋白表達的判斷標準：以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，其表達強弱與親本細胞的細胞膜表達比較。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理，t檢驗進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 形態(tài)學變化

光鏡下NCI-H1975細胞呈上皮樣單層排列生長，細胞大小不一，長梭形，細胞邊界清楚，核大，圓形或橢圓形(圖1A)；gefitinib加入24 h后，細胞邊界不清，有的變成圓形，胞核內可見粗顆粒(圖1B)，撤藥后1周左右細胞基本恢復到未加gefitinib前生長狀態(tài)；gefitinib加入后與NCI-H1975細胞相比，NCI-H1975/GR細胞體積略小，多數(shù)為長梭形，有的為圓形或紡錘形(圖1C)。

圖1 gefitinib誘導人肺腺癌NCI-H1975細胞耐藥過程中細胞形態(tài)的變化(10×10)

2.2 生長曲線

NCI-H1975和NCI-H1975/GR兩者的群體倍增時間分別為28.65 h和35.79 h，耐藥細胞生長時間較親本細胞延長7.14 h (P<0.05)。生長曲線見圖2。

2.3 NCI-H1975及NCI-H1975/GR細胞的EGFR及E-cadherin蛋白表達

(1)EGFR蛋白的表達：該蛋白在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞的細胞膜和細胞漿均呈陽性表達，在兩細胞株細胞膜的表達強度相近，但在細胞漿的表達耐藥株NCI-H1975/GR明顯強于親本株NCI-H1975(圖3)。

(2)E-cadherin蛋白的表達：在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞均呈陽性表達，但二者的表達部位不同，在NCI-H1975細胞主要表達于細胞膜，而在NCI-H1975/GR細胞則主要表達于細胞漿，在細胞膜的表達明顯減弱(圖4)。

圖2 人肺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞的生長曲線

圖3 EGFR蛋白在人肺腺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞中的表達(10×40)Fig 3 The protein expressions of EGFR in human lung adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and NCI-H1975/GR (10×40)A：NCI-H1975細胞；B：NCI-H1975/GR細胞

圖4 E-cadherin蛋白在人肺腺癌NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞中的表達(10×40)Fig 4 The protein expressions of E-cadherin in human lung adenocarcinoma cell lines NCI-H1975 and NCI-H1975/GR (10×40)A：NCI-H1975細胞；B：NCI-H1975/GR細胞

3 討 論

目前，EGFR-TKI的耐藥機制主要涉及以下幾個方面：(1)靶基因或靶蛋白的改變，如EGFR 20外顯子繼發(fā)突變，引起EGFR的構象改變，使EGFR-TKI失去了作用靶點[3-4]；(2)癌基因的擴增，如MET基因擴增激活另一信號傳導途徑ErbB3-PI3K[5-6]；(3)下游信號分子的自身活化，如K-RAS和(或)B-RAF基因外顯子突變，引起信號傳導通路下游分子的自身活化或敏感性增強[7]；(4)癌組織通過上皮-間質轉化，失去上皮組織特性，使藥物失去作用靶點[8]。要研究這些機制，體外EGFR-TKI獲得性耐藥模型必不可少。在本研究中建立的EGFR-TKI獲得性耐藥細胞株NCI-H1975/GR能在含80 μmol/L的gefitinib培養(yǎng)基中良好生長；與NCI-H1975相比藥物作用后的形態(tài)變化不一樣，群體倍增時間也明顯延長，即生長減慢。檢測結果表明NCI-H1975/GR細胞株已為gefitinib獲得性耐藥細胞株，可以用于該藥的耐藥機制研究。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是生長因子受體家族成員之一，在結構上包括3個主要功能區(qū)：胞外配體結合區(qū)、疏水跨膜區(qū)和胞質酪氨酸激酶區(qū)。當EGFR與它的配體如EGF結合后，促進受體內的酪氨酸激酶激活，導致受體酪氨酸殘基自身磷酸化，形成二聚體，從而激活信號傳導通路，引起細胞的增殖和分化[9-10]。EGFR主要表達于正常上皮細胞表面，在包括NSCLC在內的一些上皮源性腫瘤細胞常過表達。作為EGRF-TKI的作用靶蛋白，EGFR表達水平常與EGFR-TKI的治療效果密切相關。在本研究中，該蛋白在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞的細胞膜和細胞漿均呈陽性表達，在兩細胞株細胞膜的表達強度相近，但在細胞漿的表達耐藥株NCI-H1975/GR強于親本株NCI-H1975。這提示gefitinib獲得性耐藥細胞的細胞漿有較多的EGFR蛋白表達。這可能是由于EGFR-TKI阻斷了EGFR的活化，信號不能傳導到其下游途徑，使細胞生長速度減慢。此時，細胞需不斷合成EGFR蛋白以促進細胞生長，但由于細胞膜上原已存在EGFR，新合成的EGFR不能到達細胞膜行使功能，只能在細胞漿大量堆積。是否細胞漿EGFR表達增高可作為EGFR-TKI獲得性耐藥的標志，有待在臨床研究中證實。

E-cadherin 是一類主要介導細胞之間相互粘附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達在上皮細胞，廣泛參與細胞間的連接。E-cadherin正常表達對上皮細胞的分化起著重要作用；其異常表達被認為與上皮-間質轉化產生直接相關。據(jù)報道，用gefitinib誘導人肺腺癌細胞株A549或用erlotinib誘導人肺腺癌細胞HCC4006產生獲得性耐藥，耐藥細胞都發(fā)生了上皮-間質轉化，即E-cadherin表達的下降[11-12]。在本研究中， E-cadherin在NCI-H1975與NCI-H1975/GR細胞均呈陽性表達，但二者的表達部位不同，在NCI-H1975細胞主要表達于細胞膜，而在NCI-H1975/GR細胞則主要表達于細胞漿，在細胞膜的表達明顯減弱。這提示在細胞發(fā)生gefitinib獲得性耐藥后E-cadherin在它的功能部位，細胞膜的表達降低，即此時這些細胞上皮分化減弱，失去部分上皮組織特性，但這些細胞是否、何時會出現(xiàn)間質標記蛋白的表達，即發(fā)生間質轉化還需要進一步研究。

總之，EGFR作為EGFR-TKI的靶蛋白，E-cadherin作為維持細胞上皮分化的蛋白均在NSCLC細胞中高表達，可作為NSCLC上皮分化的標志蛋白。這兩種蛋白因功能的不同，在gefitinib獲得性耐藥產生過程中它們表達的變化也不同；在獲得性耐藥細胞株中，EGFR在細胞漿的表達明顯增高；E-cadherin在細胞膜的表達明顯降低。

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