多維分離策略分離半枝蓮中野黃芩苷的實驗研究

王立恒，遲曉飛，彭金詠，齊 艷，許麗娜，尹連紅，韓 旭，許有威，趙艷艷

(1.大連市第二人民醫(yī)院 康復(fù)中心，遼寧 大連 116011; 2.大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 遼寧 大連 116044)

中藥半枝蓮別名金挖耳、狹葉韓信草、并頭草等，為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barata D. Don的干燥全草[1]。臨床多用于治療肝癌、胃癌、肺癌等疾病，主要有效成分是黃酮類化合物[2-4]。野黃芩苷是半枝蓮中一種含量較高的活性物質(zhì)，其含量高低與對腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈正相關(guān)[5]，對臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形成有促進(jìn)作用[6]，另外能夠影響到神經(jīng)系統(tǒng)[7], 因此具有較高的研究價值。然而傳統(tǒng)野黃芩苷的分離制備方法主要為反復(fù)柱層析，制備方法較繁瑣，操作時間太長，重復(fù)性較差。有必要開發(fā)一種適合野黃芩苷制備的高效分離制備方法。

本研究采用多維分離策略對半枝蓮中野黃芩苷進(jìn)行分離。半枝蓮粗提物先后經(jīng)過大孔樹脂法，有機溶劑萃取法，以及高速逆流色譜法(high speed counter-current chromatography, HSCCC)在較優(yōu)的分離條件下進(jìn)行分離，并采用高效液相色譜法分析，質(zhì)譜儀鑒定所分離化合物的結(jié)構(gòu)。這種多維分離策略兼具高效、便捷的優(yōu)勢，將為高效穩(wěn)定獲取半枝蓮中野黃芩苷奠定理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

TBE-300A高速逆流色譜儀，TBP-50A恒壓恒流微量泵(同田生化技術(shù)，上海)、8823-B紫外檢測儀(新技術(shù)應(yīng)用研究所，北京)、HX-1050恒溫循環(huán)器(博醫(yī)康實驗儀器，北京)、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程，浙江)。

Agilent 1200 HPLC包括在線真空脫氣機、四元泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、Chemstation 工作站(Agilent,USA)。

API 3200三重四級桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Applied Biosystems, USA)配置有電噴霧離子源(ESI)。

半枝蓮藥材(千草源有限公司，云南)經(jīng)鑒定為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barata D. Don的干燥全草。野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所(編號為880-200001)。

甲醇、正丁醇、乙酸乙酯均為分析純試劑(科密歐，天津)；95%醫(yī)用乙醇(天源藥業(yè)，盤錦)；乙腈為色譜純試劑(TEDIA, USA)；雙蒸水由Milli-Q (Millipore, USA) 制備得到；D101大孔樹脂(天津農(nóng)藥廠，天津)；C18色譜柱(5 μm, 4.6×250 mm, 華譜新創(chuàng)科技，北京)

1.2 高效液相色譜分析條件

儀器：Agilent 1200 HPLC；色譜柱：C18；流動相：乙腈(A)，水(B)；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣體積：15 μL；梯度條件：5%A-20 min-30%A-15 min-50%A。

1.3 質(zhì)譜分析條件

負(fù)離子模式下，將樣品的甲醇溶液(1000 ng/mL)以恒定流速10 μL/min的速度泵入質(zhì)譜儀中，氮氣壓力為50 psi，電噴霧電壓和溫度分別為5500 V和700℃。氮氣作為氣簾氣和碰撞氣的壓力分別設(shè)為12 psi和6 psi，去簇電壓和入口電壓分別設(shè)為50 V和5 V。碰撞能設(shè)為20 V，錐孔電壓為35 V。

1.4 半枝蓮的提取和分離過程

半枝蓮粗提物制備方法：半枝蓮生藥材1000 g用70%的乙醇水溶液(料液比為1∶8，w/v)回流提取2次，3 h/次。兩次提取液經(jīng)過濾后合并，60℃減壓回收溶劑真空干燥后得到棕黃色粉末，密封儲存。

大孔樹脂分離方法：半枝蓮粗提物(50 g)用少量純水溶解，上樣于活化后的D101型大孔樹脂進(jìn)行分離，分別用純水、20%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，將所得的洗脫液各個組分濃縮成干燥粉末并稱重。其中20%乙醇水溶液洗脫組分命名為樣品A。

有機溶劑萃取分離方法：稱取樣品A (1.0 g)，采用正丁醇∶乙酸乙酯∶水(1∶1∶2，v/v/v)的液相體系(100 mL)進(jìn)行有機溶劑萃取，分取有機相和水相減壓揮去溶劑并真空干燥至粉末，用15%乙腈/水溶液溶解分別進(jìn)行HPLC分析。其中有機溶劑萃取的水相命名為樣品B。

HSCCC分離方法：正丁醇-水(1∶1，v/v)系統(tǒng)在室溫下靜置過夜分層，上相為固定相，下相為流動相。以10 mL/min流速將固定相泵入HSCCC中，待分離管中充滿固定相后，開啟主機，設(shè)定主機轉(zhuǎn)速為800 rpm，以1.5 mL/min流速泵入流動相，紫外檢測波長為280 nm，溫度設(shè)定為25℃。稱取樣品B (100 mg)，用20 mL分離初始條件溶液溶解，作為待分離樣品溶液，采用HSCCC分離出3個組分，分別為保留時間 113～168 min、168～235 min、固定液；所接的組分中各取出1.5 mL揮去溶劑后溶解于1 mL超純水中備用。

2 結(jié) 果

2.1 大孔樹脂分離方法

經(jīng)過大孔樹脂分離后發(fā)現(xiàn)20%乙醇水洗脫物中固形物成分含量較高，固定物質(zhì)量占上樣量比例為18.4%，半枝蓮中野黃芩苷主要存在于該組分中，具有較大的研究潛力，因此選擇20%乙醇水洗脫物(樣品A)作為后續(xù)分離制備的研究對象。

2.2 有機溶劑萃取法

經(jīng)過有機溶劑萃取后，采用HPLC對樣品A在有機相和水相中分離情況進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖1所示：有機溶劑萃取后水相化學(xué)組分成分較單一，主成分含量較高，適合在優(yōu)化的條件下進(jìn)行HSCCC繼續(xù)分離制備。因此選擇有機溶劑萃取的水層(樣品B)作為HSCCC分離對象。

2.3 高速逆流色譜法

對于極性較大的樣品B來說，采用HSCCC進(jìn)行分離，主要從極性洗脫體系進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用HSCCC分離樣品B后，固定液組分的HPLC色譜圖譜如圖2所示。

2.4 野黃芩苷結(jié)構(gòu)鑒定

在較優(yōu)的質(zhì)譜條件下，對HSCCC分離得到的主成分進(jìn)行了定性，質(zhì)譜圖如圖3所示。

圖1 有機溶劑萃取法分離各組分的色譜圖譜

圖2 HSCCC分離后組分HPLC圖譜

圖3 主成分的一級質(zhì)譜圖(A)和以284.9為母離子的二級質(zhì)譜圖(B)Fig 3 MS1 (A) and MS2 (B) mass spectrum of the main peak

一級質(zhì)譜圖中460.7為分子離子峰，為半枝蓮中主要有效成分野黃芩苷的分子離子峰，其中284.9為野黃芩苷元的碎片峰。以分子量284.9為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析后，發(fā)現(xiàn)主要斷裂碎片與王艷萍等[8-9]報道野黃芩苷元碎片斷裂規(guī)律基本一致。

另外，通過在相同高效液相色譜條件下與野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留情況相對照，能夠進(jìn)一步確定所分離的主成分為野黃芩苷。

3 討 論

本研究所開發(fā)的多維分離策略不僅能夠高效、高純度地獲得半枝蓮中的有效成分，而且具有分離流程短，目標(biāo)明確的特點。在大孔樹脂粗分離和有機溶劑萃取后，半枝蓮中野黃芩苷的成分得到較好富集，采用高速逆流色譜進(jìn)一步分離后，野黃芩苷的純度得到較大的提高，這顯示出多維分離方法在分離制備半枝蓮中有效物質(zhì)的優(yōu)勢。未見有采用這種多維分離策略分離半枝蓮中的野黃芩苷物質(zhì)的文獻(xiàn)報道。

在主成分結(jié)構(gòu)鑒定過程中，首先采用質(zhì)譜法初步推測化合物結(jié)構(gòu)，根據(jù)一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的碎片特征，并結(jié)合文獻(xiàn)報道，推測出所制備的主成分是在半枝蓮生藥材中含量較高的野黃芩苷；然后采用高效液相色譜法將主成分峰與野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留行為進(jìn)行對照，結(jié)果進(jìn)一步確定該成分結(jié)構(gòu)為野黃芩苷。

本研究能夠為從半枝蓮中制備高純度野黃芩苷活性成分奠定基礎(chǔ)，所發(fā)展的方法能夠?qū)奶烊恢参镏蟹蛛x制備活性化合物提供有意義的借鑒。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局. 中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999. 210-213.

[2] 楊連梅,劉量,胡榮,等.半枝蓮化學(xué)成分的提取和含量測定方法研究[J]. 江蘇中醫(yī)藥, 2010, 42(10): 78-79.

[3] 付欣鴿,王振華,李峰, 等.人類乳腺癌的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2004, 22(5): 455-460.

[4] Dong HQ, Ning ZX, Yu LJ, et al. Preparative separation and identification of the flavanoid phlorhizin from the crude extract of Lithocarpus polystachyus Rehd[J]. Molecules, 2007, 12(3): 552-562.

[5] 周志愉,王兆雷. 不同乙醇濃度半枝蓮提取物抗腫瘤作用的相關(guān)性研究[J]. 實用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2007, 7 (6)：89-90.

[6] Gao ZX, Huang DY, Li HX, et al. Scutellarin promotes in vitro angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 400(1)：151-156.

[7] Wang S, Wang H, Guo H, et al. Neuroprotection of Scutellarin is mediated by inhibition of microglial inflammatory activation[J]. Neuroscience, 2011, 185：150-160.

[8] 王艷萍. 黃酮類化合物的制備與表征研究[D]. 中國科學(xué)院研究生院博士學(xué)位論文, 2009：131.

[9] Wang YP, Xue XY, Xiao YS, et al. Purification and preparation of compounds from an extract of Scutellaria barbata D. Don using preparative parallel high performance liquid chromatography[J]. J Sep Sci, 2008, 31(10)：1669-1676.