煙草抗病毒相關(guān)R基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

楊 帆，李鳳霞，孫玉合，王 魯，楊愛(ài)國(guó)，蘇振剛，李元元，趙百英，劉 慧，王元英*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙草病毒病是一類危害煙草的世界性病害，早期發(fā)病損失可達(dá)50%～70%，甚至絕收，煙草病毒病的防治已成為生產(chǎn)上迫切需要解決的問(wèn)題。RNAi即 RNA干涉，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS），是轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA特異性的降解機(jī)制[1]。RNAi普遍存在于植物[2-3]、動(dòng)物[4-6]和真菌[7]等大多數(shù)真核生物中，并且可能在生命進(jìn)化的早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)了[8]，是生物體本身的一種 RNA防御機(jī)制。目前，將構(gòu)建好的沉默載體轉(zhuǎn)入植物體已經(jīng)成為較為有效的植物抗病毒基因工程方法[9-10]，即通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)RNA沉默來(lái)達(dá)到抗病毒的目的。

GATEWAY是通過(guò)重組交換的基因克隆方法，可以使目標(biāo)序列通過(guò)一次性交換到克隆載體上并形成反向重復(fù)序列[11]。本研究根據(jù)絨毛狀煙草基因組測(cè)序獲得的8個(gè)抗病毒病相關(guān)R基因的部分片段序列，采用GATEWAY技術(shù)，構(gòu)建具有反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的發(fā)卡形RNAi表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RNA超純提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒，卡那霉素（kanamycin），壯觀霉素（奇霉素，spectinomycin）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶，MarkerDL500，均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 克隆的宿主菌E.coli DH5a菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DB 3.1菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所惠贈(zèng)。GATEWAY pDONR201TM載體與pH 7 GWIWG2(I)載體由 CSIRO Plant Industry (http://www.pi.csiro.au/home.htm)惠贈(zèng)。BP clonaseTMⅡ和LR clonaseTMⅡ?yàn)槊绹?guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 含attB位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì) 將絨毛狀煙草全基因組測(cè)序獲得的580多個(gè)抗病相關(guān)基因在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行 blast比對(duì)分析、預(yù)測(cè)其功能，篩選出 8條序列與抗病毒病相關(guān) R基因高度同源，采用primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件對(duì)這8條序列設(shè)計(jì)引物，并分別在設(shè)計(jì)出的上游引物和下游引物的5′端連接特異性結(jié)合位點(diǎn)：attB1和attB2的后12個(gè)堿基序列，作為第一次PCR擴(kuò)增的引物序列（表1）。二次PCR引物為attB1和attB2序列，attB1和attB2的序列分別為attB1：GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。

1.2.2 抗病毒病相關(guān) R基因 RNAi片段的克隆2010年 12月取普通紅花煙草的幼嫩葉片提取RNA，TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以含部分attB位點(diǎn)的引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將獲得的attB-PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，以attB1和attB2全長(zhǎng)為引物進(jìn)行二次PCR，擴(kuò)增條件與第一次PCR相同。將第二次擴(kuò)增獲得attB-PCR產(chǎn)物（兩端含有特異性結(jié)合位點(diǎn)attB1和attB2的R基因片段）純化回收，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers sequences for PCR

1.2.3 相關(guān)R基因RNAi載體構(gòu)建 將GATEWAY pDONRTM201載體與pH 7 GWIWG2(I)載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DB3.1中進(jìn)行擴(kuò)繁增殖，提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

RNAi載體構(gòu)建具體操作步驟如下：

BP反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)載體：用BP ClonaseTMenzyme mix Ⅱ（Invitrogen）催化純化后的attB-PCR產(chǎn)物和pDONRTM201進(jìn)行BP反應(yīng)，反應(yīng)物在 25℃條件下反應(yīng) 1 h，然后加入 1 μL的proteinase K 酶（100 μmol/L）溶液在 37 ℃條件下溫育10 min。之后吸取1 μL反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有 50 mg/L卡那霉素（kanamycin）的LB固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)并篩選陽(yáng)性克隆，挑取單菌落到同樣含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin）的LB液體培養(yǎng)基中搖菌并提取質(zhì)粒（入門(mén)載體），經(jīng)PCR鑒定后送交TaKaRa公司測(cè)序。

LR反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體：用 LR ClonaseTMⅡenzyme mix（Invitrogen）催化入門(mén)克隆與表達(dá)載體pH 7 GWIWG2(I)進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)條件與BP反應(yīng)條件類似，25 ℃反應(yīng) 1 h后，加入 1 μL的proteinase K 酶（100 μmol/L）溶液并在 37 ℃條件下溫育10 min終止反應(yīng)。然后吸取1 μL的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 mg/L壯觀霉素（spectinomycin）的 LB固體培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)并篩選目的陽(yáng)性克隆，挑取單菌落到同樣含有50 mg/L壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌并提取質(zhì)粒（目的載體），經(jīng)PCR鑒定后保存用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增R基因片段

以普通紅花煙草cDNA為模板，在高保真Taq DNA聚合酶作用下，經(jīng)過(guò)兩次 PCR，擴(kuò)增出兩端攜帶特異性重組位點(diǎn)attB的相關(guān)抗病毒病R基因片段（圖1）。根據(jù)已知的R基因序列，8個(gè)R基因的預(yù)期片段大小分別為 216、198、193、246、285、187、300、183 bp。8個(gè)R基因的預(yù)期片段長(zhǎng)度加上兩端的特異性結(jié)合位點(diǎn)attB各29 bp，和圖中得到8個(gè)特異性電泳條帶的大小相符，說(shuō)明已經(jīng)成功擴(kuò)增到了8個(gè)R基因的目標(biāo)片段。

圖1 擴(kuò)增得到的攜帶特異性重組位點(diǎn)的8個(gè)R基因片段Fig.1 Partial sequence of R genes with specific banding site attB by PCR amplification

2.2 入門(mén)載體的檢測(cè)

對(duì)經(jīng)卡那霉素（kanamycin）篩選得到的入門(mén)克隆挑取單菌落后搖菌，提取質(zhì)粒后以質(zhì)粒為模板，以attB引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到與attB-PCR產(chǎn)物大小一致的電泳條帶，而陰性對(duì)照則不能檢測(cè)出條帶（圖 2）。測(cè)序結(jié)果顯示，除去測(cè)序產(chǎn)物兩端的attB序列，中間擴(kuò)增出的片段與絨毛狀煙草基因組測(cè)序獲得的 R基因片段序列一致，即成功構(gòu)建了pDONR 201入門(mén)載體。

圖2 入門(mén)載體的PCR鑒定Fig.2 PCR detection of entry vectors

2.3 表達(dá)載體的檢測(cè)

在含有壯觀霉素（spectinomycin）的培養(yǎng)基上篩選得到陽(yáng)性克隆，以提取到的目的載體為模板加入attB引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，同樣得到與attB-PCR產(chǎn)物大小一致的電泳條帶（圖3）。對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物序列與絨毛狀煙草基因組測(cè)序獲得的R基因片段序列一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了R基因RNAi的表達(dá)載體。

圖3 表達(dá)載體的PCR鑒定Fig.3 PCR detection of expression vectors

3 討 論

RNAi技術(shù)是近幾年生命科學(xué)界的熱點(diǎn)之一，美國(guó)Science雜志曾2年將其評(píng)選為年度十大突破技術(shù)。RNAi機(jī)制的進(jìn)一步闡明，為深入了解植物與病毒之間的互作關(guān)系提供了有力的理論依據(jù)，也為科技工作者在培育抗病毒品種方面提供一條簡(jiǎn)捷、高效的技術(shù)手段。隨著煙草基因組測(cè)序工作的完成以及許多農(nóng)作物ESP資料庫(kù)的建立，為利用反向遺傳學(xué)研究基因功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也為RNAi技術(shù)提供了更大的發(fā)展空間。只要將某個(gè)植物R基因或病毒基因的片段通過(guò)載體或者病毒轉(zhuǎn)入目標(biāo)植株或宿主體內(nèi)，就可以使目標(biāo)植株或宿主的同源基因發(fā)生降解而沉默，利用該方法可以在較短時(shí)間內(nèi)鑒定出大量基因的功能。將GATEWAY技術(shù)應(yīng)用到可以大規(guī)模篩選基因功能的 RNAi原理中，避免了傳統(tǒng)克隆技術(shù)中限制性酶切和連接的過(guò)程，使基因轉(zhuǎn)入到目標(biāo)載體的過(guò)程更加簡(jiǎn)捷、實(shí)用，為從反向遺傳學(xué)的角度研究基因功能提供了技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

關(guān)于幾種不同 RNA干擾載體構(gòu)建獲得基因表達(dá)受抑制轉(zhuǎn)基因植株的比例，Wesley等[12]經(jīng)過(guò)評(píng)價(jià)認(rèn)為，兩個(gè)反向重復(fù)序列中間含有一個(gè)內(nèi)含子所形成的ihpRNA結(jié)構(gòu)的RNA干擾載體沉默效果最好，效率平均高達(dá)90%以上。本研究使用GATEWAY的載體 pH 7 GWIWG2(I)具有兩對(duì)方向完全相反的attR結(jié)合位點(diǎn)，兩對(duì)attR結(jié)合位點(diǎn)中間有一段1 047 bp大小的內(nèi)含子片段，這樣的結(jié)構(gòu)保證了基因片段可以按照完全相反的方向插入目的載體，并且在轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)卡 RNA結(jié)構(gòu)（hpRNA）。此外，pH 7 GWIWG2(I)載體中ccdB是致死基因，只有目標(biāo)基因完全取代兩個(gè) ccdB在目的載體中的位置，轉(zhuǎn)化菌才能存活，以上兩種機(jī)制保證了LR反應(yīng)得到的表達(dá)載體的準(zhǔn)確性。RNA干擾技術(shù)中，在干涉片段的選擇上具有很大的可塑性，一般認(rèn)為從 90～1800 bp之間[13]。本研究中擴(kuò)增的8個(gè)R基因序列長(zhǎng)度從183 bp到285 bp不等（不包含兩端各29 bp的attB序列），這樣大小的干擾片段既可以保證轉(zhuǎn)基因植株的沉默效果，也避免了載體外源片段過(guò)大時(shí)構(gòu)建載體的難度，同時(shí)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化和外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的穩(wěn)定遺傳都是有利的。關(guān)于絨毛狀煙草基因組測(cè)序獲得抗病毒病相關(guān)R基因的具體功能，將在利用該沉默載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化之后進(jìn)一步分析研究。

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