中華蜜蜂有王群與無(wú)王群工蜂上顎腺10-HDA含量比較

吳麗麗 黃少康 李三妹 蔣星宏

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

反式-10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）是工蜂上顎腺的主要分泌物，也是王漿中最主要的不飽和脂肪酸之一[1]。它不僅是王漿的天然保鮮劑，而且是雌性蜜蜂幼蟲(chóng)級(jí)型發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)控因子[2]。由于上顎腺與級(jí)型發(fā)育的關(guān)系，很早就受到研究者的關(guān)注，對(duì)不同蜂種的蜂王、工蜂上顎腺中10-HDA的檢測(cè)已有不少報(bào)道。如，Plettner et al.（1993）對(duì)西方蜜蜂（Apis mellifera）的無(wú)王群采集蜂、有王群工蜂、產(chǎn)卵工蜂等的上顎腺10-HDA進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)它們的10-HDA含量上有顯著差異[3]。Plettner （1997）對(duì)5種蜜蜂的蜂王和工蜂上顎腺中包括10-HDA在內(nèi)的多種成分進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)表明，采自加拿大的西方蜜蜂越冬工蜂10-HDA含量高達(dá)95±15μg，采自馬來(lái)西亞的大蜜蜂（Apis dorsata）采集蜂的含量達(dá)56，從斯里蘭卡Horana采集的東方蜜蜂（A. cerana）外勤工蜂中僅檢測(cè)到0.8±0.2μg/bee，黑小蜜蜂（A.andreniformis）工蜂為3.2±0.5μg/bee，小蜜蜂（A.florea）工蜂為11±1μg/bee。說(shuō)明不同蜂種間工蜂，蜂王及工蜂間上顎腺10-HDA[4]等內(nèi)容物含量存在顯著差異。

蜂王的存在是蜂群完整性與穩(wěn)定性的標(biāo)志，蜂王上顎腺分泌物具抑制工蜂體內(nèi)咽側(cè)體活性，進(jìn)而延遲工蜂的出巢日齡的作用[5]。有王蜂中，工蜂各項(xiàng)活動(dòng)秩序井然；一旦失王，蜂群生物學(xué)特性以及工蜂腺體分泌物會(huì)發(fā)生顯著性變化，這在海角蜜蜂中表現(xiàn)得尤其明顯，室內(nèi)無(wú)王籠養(yǎng)的海角蜜蜂工蜂上顎腺分泌物會(huì)逐漸向蜂王方向轉(zhuǎn)化，逐漸以9-ODA為主[6]。對(duì)無(wú)王和有王狀態(tài)下小蜜蜂（A.florea）工蜂上顎腺10-HDA的檢測(cè)顯示，無(wú)王群工蜂平均含7.4μg/bee，有王群工蜂平均含10.1μg/bee，兩者之間有顯著差異[7]，說(shuō)明蜂王的有無(wú)對(duì)工蜂上顎腺10-HDA有影響。與西方蜜蜂相比，中蜂（A.cerana cerana）是一種對(duì)失王狀態(tài)更為敏感的蜂種，中蜂群失王后，群內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)卵工蜂的時(shí)間常常比西方蜜蜂短，那么，無(wú)王后，中蜂工蜂上顎腺的分泌物是否也會(huì)有所變化？在此，在有無(wú)和無(wú)王狀態(tài)下我們對(duì)中蜂工蜂上顎腺主要的分泌物10-HDA含量進(jìn)行了測(cè)定和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)王群工蜂10-HDA的含量極顯著高于有王群工蜂，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中蜂群

中蜂由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院提供，每群群勢(shì)為3～4足框。有王群9群，無(wú)王群7群。無(wú)王群失王1～2周，群內(nèi)無(wú)子、無(wú)工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象。

1.1.2 主要儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）（色譜柱：4.6mm×250mm不銹鋼柱，填充物不定形硅膠C18鍵合相，10μm）；SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（日本株式會(huì)社島津制作所）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；流動(dòng)相過(guò)濾裝置（津騰）。有機(jī)濾膜（0.45μm），一次性5ml針筒，10ml容量瓶，玻璃研磨器等。

甲醇（色譜純，德國(guó)MECK集團(tuán)有限公司）；無(wú)水乙醇，磷酸（優(yōu)級(jí)純GR），對(duì)羥基苯甲酸甲酯（分析純，含量99.0%），由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.6%，湖北揚(yáng)子江蜂業(yè)公司）。

1.2 方法

1.2.1 取樣

2010年6月10日，分別在10群中蜂有王群的巢門(mén)口抓取回巢的外勤蜂，每箱抓取工蜂約100只。從失王1～2周的7群無(wú)子、無(wú)王群中，提脾，每群取工蜂約100只以上，于-80℃冷凍保存。

1.2.2 試液的配置

（1）10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制

稱(chēng)取干燥后的10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品0.0305g，用無(wú)水乙醇溶解并移入50ml容量瓶中定容。此溶液每毫升含10-HDA 0.61mg。

（2）內(nèi)標(biāo)溶液配制

稱(chēng)取干燥過(guò)的對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1671g，加無(wú)水乙醇溶解并移入250ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。此溶液每毫升含對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.6684 mg。

（3）樣品溶液制備

剪取同群10只工蜂頭部，放入一研磨器中，加入少量甲醇研磨，用超聲波清洗器超聲5min促使其溶解。把研磨液移入已經(jīng)加入1ml內(nèi)標(biāo)溶液的10毫升容量瓶中。研磨器潤(rùn)洗2～3遍，潤(rùn)洗后的液體也移入容量瓶?jī)?nèi)，最后加甲醇定容，超聲40min后靜置過(guò)夜。用0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液即為一待測(cè)樣本。每群制備5個(gè)樣本，無(wú)王群與有王群待測(cè)樣本均同法制備。

1.2.3 色譜方法學(xué)檢測(cè)

（1）線性關(guān)系考察

精密量取10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0至10.0ml容量瓶中。精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1ml，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取10μl注入液相色譜儀，210nm測(cè)定。結(jié)果表明，10-HDA進(jìn)樣量（X）在0.122～2.44μg范圍內(nèi)與峰面積（Y）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程Y=2×10-5X+1.0167，R2=0.9999。

（2）精密度試驗(yàn)

自動(dòng)進(jìn)樣10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得10-HDA峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%（n=5），進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取中蜂工蜂頭部樣品10μl進(jìn)樣分析，分別于1h、4h、8h、12h、24h時(shí)重復(fù)一次，測(cè)得10-HDA峰面積的RSD為1.2%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取已知10-HDA含量的樣本，分別加入適量的10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品，制備樣品溶液，進(jìn)樣10μl，測(cè)得10-HDA的回收率均在95%以上。

1.2.4 樣品10-HDA含量測(cè)定

取待測(cè)樣品，按以下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜柱：20RBAX Eclipse XDB-C18，（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（55：45）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μl。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)HPLC檢測(cè)所得10-HDA的峰面積換算得到工蜂10-HDA的含量。用SPSS軟件中Levene test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)方差齊性數(shù)據(jù)用one-way ANOVA中的LSD法對(duì)進(jìn)行多重顯著性分析，對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)組用one-way ANOVA中Dunett T3法進(jìn)行多重顯著性分析。用t-test對(duì)無(wú)王群和有王群工蜂10-HDA的含量進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果與分析

對(duì)中蜂有王群10群及無(wú)王群7群工蜂上顎腺10-HDA含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。有王群中，每只工蜂頭部10-HDA的平均含量為2.75±1.05μg（N=50）。不同蜂群間工蜂上顎腺10-HDA含量方差不齊，存在顯著差異（Levene test，P＝0.02＜0.05），故采用SPSS中unequal variance ANOVA的Dunett T3進(jìn)行多重顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果表明，1號(hào)群的10-HDA含量顯著低于4、6、7號(hào)群（p＝0.014，0.006，0.02＜0.05）。7號(hào)群外勤蜂10-HDA含量。

平均含量高達(dá)4.76±0.41μg，顯著高于1，2，3群（P=0.02，0.05，0.032≤0.05）。2，3，4，5，8，9，10號(hào)群間無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明多數(shù)有王群間采集蜂的10-HDA含量無(wú)顯著差異，僅個(gè)別蜂群（1和7號(hào)群）含量存在差異。由于我們的樣本未明確日齡，還不能完全排除這種差異由日齡差異引起的可能性。

無(wú)王群工蜂10-HDA的平均含量為5.47μg（N＝35），為有王群工蜂含量的2倍，極顯著高于有王群工蜂（t-test，P＝0.000＜0.01）。因?yàn)闊o(wú)王群各群間數(shù)據(jù)方差齊性（Levene test，P=0.58＞0.05），故采用LSD法進(jìn)行多重顯著性差異比較，結(jié)果顯示，無(wú)王群中1號(hào)群工蜂10HDA平均含量均極顯著高于2至7群（P=0.004，0.000，0.001，0.000，0.000，0.000＜0.01），10-HDA平均含量達(dá)8.32μg，其余各群之間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 中蜂有王群和無(wú)王群工蜂10-HDA含量比較

3 討論

本試驗(yàn)中所選用的無(wú)王群均為群內(nèi)無(wú)子（卵、幼蟲(chóng)、蛹），且無(wú)工蜂產(chǎn)卵現(xiàn)象，工蜂主要從事花蜜采集；有王群工蜂均為回巢的工蜂，主要從事的也是采集活動(dòng)，它們都不需要承擔(dān)育子的工作，上顎腺不需要為承擔(dān)哺育幼蟲(chóng)而提供10-HDA，因此，蜂群對(duì)這些工蜂的功能需求可以認(rèn)為是相近的，即兩種樣本之間的主要差異是有王與無(wú)王的差異。在有王狀態(tài)下，蜂王上顎腺信息素對(duì)工蜂的生理和行為都具有顯著的控制作用，能抑制工蜂上顎腺向蜂王方向轉(zhuǎn)變，因此，我們認(rèn)為，中蜂無(wú)王群工蜂10-HDA平均含量顯著高于有王群工蜂的現(xiàn)象主要與蜂群的無(wú)王狀態(tài)有關(guān)，即失無(wú)王狀態(tài)導(dǎo)致中蜂群內(nèi)工蜂的10-HDA含量顯著上升，而這種變化的出現(xiàn)，可能是因?yàn)闊o(wú)王群中沒(méi)有了蜂王上顎腺信息素抑制因子的存在，從而對(duì)工蜂咽側(cè)體產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響保幼激素（JH）的分泌，再對(duì)上顎腺產(chǎn)生影響的調(diào)控途徑完成。但本試驗(yàn)結(jié)果與小蜜蜂[7]中的報(bào)道現(xiàn)象不同，具體原因尚不清楚。因?yàn)楸敬螞](méi)有對(duì)測(cè)試工蜂的日齡進(jìn)行控制，所以仍有必要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證，同時(shí)，搞清這種變化的內(nèi)部生理機(jī)制有助于揭示10-HDA的調(diào)控機(jī)制。

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