Cr(Ⅵ)對肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)的影響以及與能量代謝障礙的關(guān)系

鄒悅，鐘才高，曾明，劉新民，肖芳，李鵬，楊淵

(中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長沙410078)

Cr(Ⅵ)對肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)的影響以及與能量代謝障礙的關(guān)系

鄒悅，鐘才高，曾明，劉新民，肖芳，李鵬，楊淵

(中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)系，湖南長沙410078)

目的探討Cr(Ⅵ)對肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平與能量代謝的影響及其相互聯(lián)系。方法用Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1分別處理體外培養(yǎng)的人胚L-02肝細(xì)胞24 h后，用細(xì)胞總RNA提取試劑盒分離RNA，線粒體ATP酶6和ATP酶8 mRNA表達(dá)水平用逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定;細(xì)胞ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性與細(xì)胞活性氧(ROS)含量分別用化學(xué)發(fā)光法、紫外分光光度法和熒光分光光度法檢測。結(jié)果與正常對照組相比，Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1使ROS顯著升高(P＜0.05);與正常對照組相比，Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1可使ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平增高(P＜0.05)，Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1使之明顯降低(P＜0.05);而呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性及細(xì)胞內(nèi)ATP含量均隨Cr(Ⅵ)濃度的增加而顯著降低(P＜0.05)。ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)與呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性及細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈正相關(guān)(r=0.858，0.795，0.809，0.766，P＜0.01)，與ROS水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.738，-0.801，P＜0.01)。結(jié)論Cr(Ⅵ)能誘導(dǎo)肝細(xì)胞ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平改變，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性及細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低。

鉻;肝細(xì)胞;線粒體;能量代謝;腺苷三磷酸酶類

隨著鉻及其化合物在近代工業(yè)中的生產(chǎn)與應(yīng)用，鉻的生物損害已引起高度重視。六價鉻〔hexavalent chromium，Cr(Ⅵ)〕具有潛在的肝毒性和致癌性。研究發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅵ)可使肝出現(xiàn)明顯的形態(tài)和功能異常，誘導(dǎo)人和小鼠細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并與肺癌的發(fā)生有關(guān)［1-3］。Cr(Ⅵ)通過細(xì)胞膜表面的非特異性陰離子通道(SO42-/HPO4

2-)進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)逐步還原為Cr(Ⅴ)，Cr(Ⅳ)與Cr(Ⅲ)，并產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，引發(fā)細(xì)胞氧化損傷，形成Cr-DNA加合物、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)及DNA-DNA交聯(lián)［4］，DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯過程受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)等生物大分子的活性。肝是機(jī)體物質(zhì)代謝和能量代謝的重要器官，而線粒體是肝細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的重要場所，通過氧化磷酸化合成ATP，為生命活動提供能量。線粒體能量代謝過程受線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeabilitytransition pore，MPTP)開放度、膜電位、呼吸鏈復(fù)合體酶活性、線粒體DNA功能及結(jié)構(gòu)的完整性等多種因素的影響［5-6］。線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ，又稱F1F0-ATP酶，在肝組織中含量豐富，F(xiàn)1F0-ATP酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，由16個亞基組成［7-8］，其中由線粒體DNA編碼的ATP酶6和ATP酶8亞基與細(xì)胞能量代謝關(guān)系密切。ATP酶6和ATP酶8基因的損傷可導(dǎo)致線粒體ATP合成障礙、能量代謝紊亂。本研究測定了不同濃度Cr(Ⅵ)處理的L-02肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性及ROS水平的變化，并分析它們之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步探索Cr(Ⅵ)所致線粒體能量代謝障礙的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人胚肝細(xì)胞系L-02(L-02肝細(xì)胞)購自上海中科院細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1.2 試劑和儀器

重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，購自美國Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，購自美國Solarbio公司;新生牛血清購自杭州四季青公司;噻唑藍(lán)(MTT)，購自美國Ameresco公司;細(xì)胞總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Fermentas公司;2×Taq PCR MasterMix和SYBR Green-RealMasterMix，購自北京天根公司;線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅴ活性比色法定量檢測試劑盒購自美國Genmde公司;ATP檢測試劑盒和細(xì)胞ROS檢測試劑盒購自南京碧云天公司。

HH·CP-T型CO2培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品;TGL-20M高速冷凍離心機(jī)為長沙平凡儀表有限公司產(chǎn)品;Varioskan Flash3001多功能酶標(biāo)儀為美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品;Mastercycler Realplex 2熒光定量PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 L-02肝細(xì)胞培養(yǎng)和Cr(Ⅵ)濃度確定

按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d用0.25%胰酶進(jìn)行消化，并傳代1次。

用MTT法測定細(xì)胞存活率。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106L-1，以每孔100 μl接種于96孔板，置37℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。設(shè)Cr(Ⅵ)2，4，8，16，32，64和128 μmol·L-1組和1個空白對照組，處理24 h后，加入10 μl MTT溶液5 g·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入甲臜裂解液100 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育6 h，震蕩5 min，于波長492 nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度(absorbance，A)，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=A處理組/A對照組×100%。

根據(jù)細(xì)胞存活率結(jié)果，選擇細(xì)胞存活率大于70%的Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度，處理時間24 h。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中，不同濃度Cr(Ⅵ)處理24 h后，收集細(xì)胞。1∶1000用無血清培養(yǎng)基稀釋熒光探針DCFH-DA，終濃度為10 μmol·L-1，收集細(xì)胞后懸浮于已稀釋的DCFH-DA中，細(xì)胞密度2×109L-1，37℃孵育30 min，每5 min混勻1次。用無血清培養(yǎng)基洗滌3次。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處，熒光酶標(biāo)儀檢測各組熒光強(qiáng)度。

1.5 線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平檢測

根據(jù)GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫中的人類線粒體基因全序列應(yīng)用Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所的www primer picking software(引物3)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。β-肌動蛋白作為內(nèi)對照，引物設(shè)計(jì)如下。

ATP酶6(613 bp)上游引物:5'-CTGTTCGCTTCATTCATTGC-3';下游引物:5'-TTAAGGCGACAGCGATTTCT-3';ATP合成酶8(170 bp)上游引物:5'-ATGGCCCACCATAATTACCC-3';下游引物:5'-GCAATGAATGAAGCGAACAG-3';β-肌動蛋白(318 bp)上游引物:5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3';下游引物:5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。

1.5.1 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按細(xì)胞總RNA提取試劑盒的說明書要求操作，分離RNA的有關(guān)物品均以焦碳酸二乙酯浸泡，高溫高壓消毒處理。提取細(xì)胞總RNA后，立即用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃60 min，70℃5 min。

1.5.2 PCR及熒光定量PCR(qRT-PCR)測定ATP酶6和ATP酶8基因相對表達(dá)水平

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA模板分別用ATP酶6和ATP酶8特異性引物進(jìn)行普通PCR及qPCR反應(yīng)擴(kuò)增，并以β肌動蛋白作為內(nèi)參照，PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系總體積為25 μl，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，反應(yīng)35個循環(huán)，72℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)成像分析，證實(shí)特異性地擴(kuò)增出ATP酶6和ATP酶8目的基因。ATP酶6和ATP酶8基因相對表達(dá)水平以目的基因與內(nèi)參基因灰度值比值表示。qPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系25 μl，擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共40個循環(huán)。參考文獻(xiàn)［9］的方法計(jì)算Cr(Ⅵ)組ATP酶6和ATP酶8基因相對表達(dá)水平。

1.6 線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性的測定

［10］的方法從L-02肝細(xì)胞中提取線粒體，收集各Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞，細(xì)胞量約4×107L-1，加入緩沖液A(mmol·L-1:蔗糖250，HEPES 2，EGTA 0.1，pH 7.4)懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中勻漿5 min，4℃600×g離心10 min，收集上清4℃7000×g離心10 min，棄上清，緩沖液A懸浮沉淀，4℃7000×g離心10 min，所得沉淀即為線粒體，所有步驟均在冰上操作。采用Bradford法［11］測定線粒體蛋白濃度，調(diào)整各處理組待測線粒體蛋白濃度為0.1 g·L-1。按照GENMED線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅴ活性光譜法定量檢測試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)步驟操作。于340 nm處測定各組吸光度(absorbance，A340nm)，間隔30 s，記錄5 min內(nèi)A值的變化。肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ活性=〔(A樣品-A背景)×樣品稀釋倍數(shù)〕/〔0.1(樣品容量;ml×6.22)〕/線粒體蛋白濃度。酶活性單位為mmol·min-1·g-1蛋白。

1.7 細(xì)胞ATP含量測定

將處于對數(shù)生長期的L-02肝細(xì)胞，接種于6孔板中，分別以Cr(Ⅵ)0，2，8和32 μmol·L-1處理24 h，每孔加入200 μl裂解液，4℃下12 000×g離心10 min，取上清，用于后續(xù)測定。向96孔板檢測孔中，每孔加入100 μl ATP檢測工作液，室溫放置3～5 min;每孔加入50 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻并用Luminometer測定相對光單位(relative light unit，RLU)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中ATP的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Cr(Ⅵ)對L-02肝細(xì)胞存活率的影響

由圖1可見，L-02肝細(xì)胞存活率隨Cr(Ⅵ)處理濃度升高而降低，存在明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.888，P＜0.05)。

Fig.1 Effect of Cr(Ⅵ)on L-02 hepatocyte survival rate.L-02 hepatocytes were plated in 96-well plates at the density of 5×106L-1 and incubated for 24 h.Cell viability was determined by MTT assay after treatment with Cr(Ⅵ)for another 24 h.Survival rate(%)=A492nmin test group/A492nmin negative control group×100%.±s，n=6.

2.2 Cr(Ⅵ)對L-02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

如表1所示，Cr(Ⅵ)處理24 h后，各處理組肝細(xì)胞ROS水平隨染毒濃度增加均有不同程度的增高，熒光強(qiáng)度逐漸增大，其中Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對照組比較顯著增高(P＜0.05)。Cr(Ⅵ)濃度與肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平之間存在明顯正相關(guān)(r=0.993，P＜0.05)。

Tab.1 Effect of Cr(Ⅵ)on reactive oxygen species(ROS)level in L-02 hepatocytes

2.3 Cr(Ⅵ)對L-02肝細(xì)胞線粒體編碼基因ATP酶6和ATP酶8 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.1 RT-PCR法考察Cr(Ⅵ)對ATP合成酶6和ATP合成酶8基因表達(dá)的影響

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ATPase 6 mRNA by RT-PCR in L-02 hepatocytes treated with Cr(Ⅵ)for 24 h.A:total cellular RNA was isolated from L-02 hepatocytes and reverse transcription of RNA was done in a final volume of 20 μl.B:semiquantitative result of A.M:marker;1:normal control;2-4:Cr(Ⅵ)2，8 and 32 μmol·L-1，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of ATPase 8 mRNA by qRT-PCR in L-02 hepatocytes treated with Cr(Ⅵ)for 24 h.A:total cellular RNA was isolated from L-02 hepatocytes and reverse transcription of RNA was done in a final volume of 20 μl.B:semiquantiative result of A.M:marker;lane 1:control group;lane 2-4:Cr(Ⅵ)2，8 and 32 μmol·L-1，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

圖2和圖3結(jié)果表明，應(yīng)用肝細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，對ATP酶6和ATP酶8基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，證實(shí)PCR產(chǎn)物分別為ATP酶6和ATP酶8基因片段。正常對照組ATP酶6和ATP酶8基因mRNA有一定程度的表達(dá)，與正常對照組比較，隨Cr(Ⅵ)濃度的增加，二者表達(dá)水平呈先增加后減少的趨勢，Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1組ATP酶6和ATP酶8 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，但Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1組ATP酶6和ATP酶8 mRNA表達(dá)最高，而Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1組相應(yīng)表達(dá)隨劑量降低。

2.3.2 qRT-PCR法考察Cr(Ⅵ)對ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)的影響

由表2所示，Cr(Ⅵ)0，2，8和32 μmol·L-1，線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，其中Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1組ATP合成酶6基因表達(dá)水平為正常對照組的1.45倍，Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1組ATP酶6基因表達(dá)水平分別為對照組的25%和5%(P＜0.01)，Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1ATP酶8基因表達(dá)水平為正常對照組的2.54倍，Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1組ATP酶8基因表達(dá)水平分別為正常對照組的42%和26%(P＜0.01)。

Tab.2 Effect of Cr(Ⅵ)on ATPase 6 and ATPase 8 mRNA expression in L-02 hepatocytes

2.4 Cr(Ⅵ)對L-02肝細(xì)胞線粒體復(fù)合體酶Ⅴ活性及ATP含量的影響

由表3可知，隨著Cr(Ⅵ)0，2，8和32 μmol·L-1濃度增高，線粒體復(fù)合體酶Ⅴ活性有逐漸降低的趨勢，與正常對照組(1.37±0.16)mmol·min-1·g-1蛋白相比，Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1組復(fù)合體酶Ⅴ活性顯著降低，分別為1.27±0.23，0.92±0.08和(0.58±0.02)mmol·min-1·g-1蛋白(P＜0.05，P＜0.01);而與正常對照組(13.78±0.48)μmol·g-1蛋白相比，Cr(Ⅵ)2，8和32 μmol·L-1組肝細(xì)胞ATP含量顯著降低，分別為9.00±0.23，6.33±0.09和(4.69±0.10)mmol·g-1蛋白(P＜0.01)。

Tab.3 Effects of Cr(Ⅵ)on complexⅤand ATP in L-02 hepatocyte

2.5 肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因mRNA表達(dá)水平與ATP含量、ROS水平及復(fù)合體酶Ⅴ活性的相關(guān)分析

由表4所見，在Cr(Ⅵ)0～32 μmol·L-1范圍，L-02肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)與復(fù)合體酶Ⅴ活性及ATP含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.858，0.795和0.809，0.766(P＜0.01)，與ROS含量均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.738和-0.801(P＜0.01)。

Tab.4 Correlation coefficients between ATPase 6 and ATPase 8 genes expression levels wth energy metabolism and oxidative damage

3 討論

線粒體是細(xì)胞的能源中心，是化學(xué)毒物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性最為敏感的細(xì)胞器，其能量代謝障礙是許多化學(xué)毒物毒性的生物效應(yīng)學(xué)標(biāo)志［12］。Cr(Ⅵ)對細(xì)胞的損害作用主要取決于Cr(Ⅵ)還原過程中產(chǎn)生的ROS對細(xì)胞生物大分子如RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等的氧化損傷以及Cr(Ⅵ)還原產(chǎn)物與DNA形成加合物造成的遺傳學(xué)損傷［13-14］。mtDNA是唯一存在于細(xì)胞核以外的遺傳物質(zhì)，編碼區(qū)共37個基因，其中與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的13個基因所編碼的蛋白質(zhì)均是線粒體呼吸鏈各亞單位的組成部分［15］。mtDNA直接暴露于氧化磷酸化過程產(chǎn)生的ROS中，加之缺乏組蛋白和其他結(jié)合蛋白的保護(hù)以及沒有完善的損傷修復(fù)系統(tǒng)，致使mtDNA對氧化損傷有較高的敏感性，與細(xì)胞核DNA相比其突變率更高［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高，而肝細(xì)胞線粒體ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平下降，二者呈負(fù)相關(guān)。Sánchez-Alcázar等［17］也發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α通過誘導(dǎo)L-929細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致ATP酶6和ATP酶8基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。用甘氨鵝脫氧膽酸處理L-02肝細(xì)胞，結(jié)果顯示過量ROS的產(chǎn)生能導(dǎo)致mtDNA基因表達(dá)的改變和線粒體功能障礙［18］。Cr(Ⅵ)引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增高具有濃度和時間依賴性［19］，ROS可攻擊mtDNA導(dǎo)致其斷裂，破壞mtDNA結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而影響下游的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，這可能是Cr(Ⅵ)引起ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)水平發(fā)生改變的原因之一。

線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅴ，即F1F0-ATP酶，是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化和水解ATP的關(guān)鍵酶，ATP酶6和ATP酶8基因編碼F1F0-ATP酶復(fù)合物的F0部分，主要參與ATP的生成，對于維持肝細(xì)胞線粒體能量代謝十分重要，但ATP酶6和ATP酶8基因保守性低，容易發(fā)生突變［20］，繼之可引起基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。研究表明，mtDNA編碼基因表達(dá)水平的改變會引起線粒體功能障礙［6］。本研究中，Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1可上調(diào)ATP酶6和ATP酶8基因mRNA表達(dá)，但Cr(Ⅵ)8和32 μmol·L-1使ATP酶6和ATP酶8基因的表達(dá)顯著降低。可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腃r(Ⅵ)誘導(dǎo)mtDNA的損傷，促使mtDNA拷貝數(shù)代償性增多［21］，或通過核基因編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的代償性調(diào)控使mtDNA表達(dá)增強(qiáng)，ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)上調(diào)，當(dāng)Cr(Ⅵ)濃度超過某一水平時，對mtDNA表達(dá)的抑制作用超出了細(xì)胞代償性調(diào)節(jié)的能力，ATP酶6和ATP酶8基因的表達(dá)下調(diào)。對乙醇毒性效應(yīng)的研究顯示，乙醇可以降低mtDNA編碼的線粒體ATP酶的表達(dá)，損傷線粒體功能，進(jìn)而影響ATP的產(chǎn)生［22］。Dey等［23］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Cr(Ⅵ)處理后，總ATP酶和Na+，K+-ATP酶的活性都明顯受到抑制。本研究中隨著Cr(Ⅵ)濃度的增高細(xì)胞F1F0-ATP酶活性呈降低的趨勢，并以Cr(Ⅵ)32 μmol·L-1組降低最為明顯，同時各Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞內(nèi)ATP含量均顯著降低，提示Cr(Ⅵ)可引起ATP合成酶6和ATP合成酶8基因轉(zhuǎn)錄過程改變或受阻，ATP酶6和ATP酶8表達(dá)下降，導(dǎo)致F1F0-ATP酶活性降低，引起F0質(zhì)子通道障礙，阻礙了線粒體內(nèi)膜外質(zhì)子通過F0質(zhì)子通道的流回，影響ADP磷酸化形成ATP，導(dǎo)致ATP合成減少。相關(guān)分析結(jié)果顯示，ATP酶6和ATP酶8表達(dá)水平與F1F0-ATP酶活性及ATP含量之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明線粒體能量代謝障礙與ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)之間存在聯(lián)系。本研究還發(fā)現(xiàn)ATP酶6表達(dá)水平較ATP酶8降低更為明顯，這反映出氧化應(yīng)激引起線粒體F1F0-ATP酶亞單位基因表達(dá)改變的強(qiáng)度不同。Li等［24］用不同濃度的過氧化氫處理腸上皮細(xì)胞，ATP酶6的mRNA表達(dá)明顯降低，而ATP酶8的mRNA表達(dá)無明顯改變，提示線粒體F1F0-ATP酶亞單位基因表達(dá)對氧化應(yīng)激的敏感性存在差異。另外，值得注意的是Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1組ATP酶6和ATP酶8 mRNA表達(dá)增高但F1F0-ATP酶活性降低，揭示低濃度的Cr(Ⅵ)雖然使ATP酶6和ATP酶8基因表達(dá)增強(qiáng)，但蛋白的合成過程可能受阻，導(dǎo)致蛋白合成減少，F(xiàn)1F0-ATP酶活性或數(shù)量降低，無法合成足夠的ATP以滿足細(xì)胞的能量需求。

目前關(guān)于Cr(Ⅵ)引起細(xì)胞能量代謝障礙的分子機(jī)制研究，主要關(guān)注于Cr(Ⅵ)對核DNA的影響，對線粒體DNA的損傷以及轉(zhuǎn)錄翻譯水平影響的報道較少。Cr(Ⅵ)所致的線粒呼吸鏈蛋白亞基表達(dá)水平的變化與細(xì)胞能量代謝緊密相連，既受到mtDNA的影響又受核DNA調(diào)控。要全面闡明Cr(Ⅵ)影響細(xì)胞能量代謝的分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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Effect of Cr(Ⅵ)on mitochondrial ATPase 6 and ATPase 8 genes expression and its relation with dysfunction of energy metabolism in hepatocytes

ZOU Yue，ZHONG Cai-gao，ZENG Ming，LIU Xin-min，XIAO Fang，LI Peng，YANG Yuan
(Department of Health Toxicology，School of Public Health，Central South University，Changsha410078，China)

OBJECTIVETo explore the correlation between mitochondrial DNA ATPase 6 and ATPase 8 genes expression and dysfunction of energy metabolism in L-02 hepatocytes treated with hexavalent chromium〔Cr(Ⅵ)〕.METHODSL-02 hepatocytes were treated with Cr(Ⅵ)2，8 and 32 μmol·L-1，respectively，for 24 h and then harvested.Total RNA was extracted from L-02 hepatocytes using RNA extraction kit.The quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)was applied to detect the mRNA levels of ATPase 6 and ATPase 8 genes.The content of ATP was measured by bioluminescence technique.The activity of mitochondrial respiratory chain complexⅤand the level of cellular ROS were determined by ultraviolet spectrophotometry and fluorometric methods，respectively.RESULTSCompared with normal control group，ROS level significantly increased in Cr(Ⅵ)2，8 and 32 μmol·L-1groups.Compared with normal control group，the expression levels of ATPase 6 and ATPase 8 genes in Cr(Ⅵ)2 μmol·L-1group firstly increased(P＜0.05)，then they gradually decreased in Cr(Ⅵ)8 and 32 μmol·L-1groups，while the activity of mitochondrial respiratory chain complexⅤand cellular ATP level significantly decreased(P＜0.05).The relative analysis showed the complexⅤactivity was positively correlated with ATPase 6 and ATPase 8 genes expression levels(r=0.858，0.809，P＜0.01)，and the cellular ATP level was yet positively correlated with ATPase 6 and ATPase 8 genes expression levels(r=0.795，0.766，P＜0.01).But ROS level was negatively correlated with ATPase 6 and ATPase 8 genes expression levels(r=-0.738，-0.801，P＜0.01).CONCLUSIONCr(Ⅵ)can induce expression changes in mitochondrial encoding ATPase genes，and this might result in the decrease in the complexⅤactivity and ATP synthesis.

chromium;hepatocytes;mitochondria;energy metabolism;adenosine triphophatases

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30972511)

ZHONG Cai-gao，E-mail:zcg54@syxm.net，Tel:(0731)84805461

R995

A

1000-3002(2012)06-0853-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.013

國家自然科學(xué)基金(30972511)

鄒悅(1986-)，女，碩士研究生，主要從事肝臟毒理學(xué)研究;鐘才高，(1954-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肝臟毒理學(xué)研究。

鐘才高，E-mail:zcg54@syxm.net，Tel:(0731)84487130

2011-12-26接受日期:2012-04-30)

(本文編輯:付良青)