線性探針技術(shù)用于快速篩查耐多藥結(jié)核病的研究

時(shí)金艷，李鐵成,夏榮榮,許衛(wèi)國(guó)

(1、連云港市第四人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000;2、江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢傳科，江蘇 南京210009)

線性探針技術(shù)用于快速篩查耐多藥結(jié)核病的研究

時(shí)金艷1，李鐵成1,夏榮榮1,許衛(wèi)國(guó)2

(1、連云港市第四人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000;2、江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢傳科，江蘇 南京210009)

目的評(píng)價(jià)線性探針技術(shù)(LPA)快速篩查臨床耐多藥結(jié)核病人的效能。方法應(yīng)用病例對(duì)照研究方法，連續(xù)收集326例臨床涂陽(yáng)病人的痰標(biāo)本，進(jìn)行傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)和線性探針技術(shù)檢測(cè)利福平(RFP)和異煙肼(INH)的耐藥性，分析線性探針?lè)椒▽?duì)診斷耐多藥結(jié)核病的敏感度和特異度。結(jié)果以比例法為參照，線性探針技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的敏感度為70%，特異度為97%，結(jié)果無(wú)顯著性差異，報(bào)告結(jié)果時(shí)間為20d，明顯低于傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)報(bào)告時(shí)間。結(jié)論線性探針耐多藥檢測(cè)技術(shù)特異性高，快速便捷，可以用于臨床耐多藥結(jié)核病診斷。

線性探針技術(shù)；耐多藥結(jié)核病

自1944年鏈霉素研究成功，結(jié)核病由無(wú)藥可治到有藥可治，并逐漸從長(zhǎng)程化學(xué)藥物治療進(jìn)入到短程化學(xué)藥物治療時(shí)代。由于防范控制的松懈與藥物使用監(jiān)督機(jī)制等的缺陷,有些結(jié)核病患者的療程達(dá)2年以上，其根源是耐多藥結(jié)核桿菌(MDRTB)[1]，耐多藥(MDR-TB)和嚴(yán)重耐多藥(XDR-TB)菌株的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的有效控制更加難以實(shí)現(xiàn)。WHO已將中國(guó)列為耐藥結(jié)核病“特別引起警示的國(guó)家和地區(qū)”之一，MDR-TB這一威脅全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題已引起各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為新的研究熱點(diǎn)[2]。

傳統(tǒng)的結(jié)核菌耐藥性檢測(cè)方法為結(jié)核菌培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)，所需時(shí)間長(zhǎng)，不利于臨床的及時(shí)、正確診斷。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展，開(kāi)發(fā)了多種快速檢測(cè)結(jié)核菌耐藥性的方法，如：基因芯片技術(shù)、線性探針雜交檢測(cè)等方法，大大縮短了檢測(cè)周期，有利于臨床醫(yī)生的早期診斷和治療方案的確定，一定程度上也減輕了患者的治療費(fèi)用負(fù)擔(dān)。線性探針技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，采用試紙條雜交技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)最常見(jiàn)的rpoB和katG/inhA基因突變，確定結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平(rifampicin,RFP)和異煙肼(isoniazid,INH)的耐藥性[3]，可以在24h內(nèi)出結(jié)果。本研究通過(guò)用該方法檢測(cè)326例臨床涂陽(yáng)結(jié)核病人的痰標(biāo)本，評(píng)價(jià)其在醫(yī)院快速篩查MDR結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 來(lái)自連云港市區(qū)及所轄區(qū)縣的初診涂陽(yáng)結(jié)核病人的涂陽(yáng)痰標(biāo)本。

1.1.2試劑 MTBDR-Plus Kit(Hain life science,Germany),高保真熱啟動(dòng)酶 (HotStar Taq酶，Qiagen)。

1.2 方法

1.2.1 采用病例對(duì)照方法，對(duì)所有入選標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏試驗(yàn)和線性探針技術(shù)檢測(cè)。

1.2.2 比例法藥敏 參照WHO/IUATLD標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)采用中和離心法，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)制成1 mg/ml菌懸液，梯度稀釋為10-2和10-4mg/ml，分別接種含 RFP(40 μg/ml)和 INH(0.2μg/ml)的羅氏固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6周后讀菌落數(shù)，計(jì)算耐藥百分比，耐藥百分比≤1%為敏感(S)，>1%為耐藥(R)。RFP和INH同時(shí)耐藥為MDR，否則為非MDR。

1.2.3 核酸提取 1ml痰標(biāo)本消化液，12000r/min離心5 min后，棄上清，加150μl無(wú)菌高純水中，充分混懸沉淀，95℃水浴20 min，之后超聲15 min,12 000r/min離心5 min后，將上清轉(zhuǎn)移到另一管，取5μl用于PCR擴(kuò)增，剩余-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增準(zhǔn)備含有DNA聚合酶的擴(kuò)增體系45μl，加5μl提取的 DNA模板，上機(jī)擴(kuò)增:95℃ 15 min;95℃ 30s,58℃ 2 min,10個(gè)循環(huán);95℃25s,53℃ 40s,70℃ 40s,20個(gè)循環(huán)；70℃ 8 min。直接取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl進(jìn)行雜交檢測(cè)。

1.2.5 雜交 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)化學(xué)變性后，與帶有探針固化的試紙條雜交，通過(guò)顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交。

1.2.6 結(jié)果判定 見(jiàn)圖1RFP和INH突變檢測(cè)圖示，其中有3個(gè)質(zhì)控探針，1個(gè)探針(AC)是擴(kuò)增對(duì)照，用于質(zhì)控?cái)U(kuò)增系統(tǒng);1個(gè)探針(CC)是用于質(zhì)控顯色反應(yīng);1個(gè)探針是特異檢測(cè)23rRNA基因(tub)。并且有24個(gè)檢測(cè)探針，1個(gè)探針是特異性檢測(cè)rpoB基因，8個(gè)rpoB野生位點(diǎn)探針，4個(gè)rpoB常見(jiàn)突變位點(diǎn)探針;1個(gè)探針特異性檢測(cè)katG基因，1個(gè)katG野生位點(diǎn)探針，2個(gè)katG突變位點(diǎn)探針;1個(gè)探針特異性檢測(cè)inhA基因，2個(gè)inhA野生位點(diǎn)探針，4個(gè)inhA突變位點(diǎn)探針。當(dāng)任一基因的野生位點(diǎn)出現(xiàn)顯色缺失，并且突變位點(diǎn)有顯色時(shí)，認(rèn)為是發(fā)生了突變，判定為耐藥;野生位點(diǎn)未缺失，突變位點(diǎn)未顯色，判定為敏感。如果擴(kuò)增對(duì)照或tub對(duì)照條帶缺失，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn);顯色反應(yīng)條帶較淺時(shí)不需重做。

1.2.7 結(jié)果分析 應(yīng)用STATA8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性痰標(biāo)本的耐藥性檢測(cè)比較采用配對(duì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 RFP和INH突變檢測(cè)圖示

2 結(jié)果

2.1 線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏方法檢測(cè)耐多藥結(jié)果分析 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性臨床痰標(biāo)本的結(jié)果：比例法對(duì)MDR TB檢出率為17.18%(56/326)，MTBDR-Plus方法對(duì)MDR-TB檢出率為14.72%(48/326)，通過(guò)配對(duì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)可見(jiàn)，兩種方法檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，符合度一致。

2.2 線性探針技術(shù)檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的效能 以比例法藥敏結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針技術(shù)檢測(cè)利福平的靈敏度為86%，高于異煙肼的靈敏度76%，檢測(cè)利福平和異煙肼的特異性分別為93%和95%。

2.3 線性探針技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的效能 以比例法藥敏結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針?lè)椒z測(cè)MDR結(jié)核病的敏感度為70%(39/56)，特異度為97%(261/270)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值81%(39/48)，陰性預(yù)測(cè)值94%(261/278)，見(jiàn)表 3。

2.4 線性探針技術(shù)檢測(cè) MDR TB的報(bào)告時(shí)間比較痰標(biāo)本從區(qū)縣運(yùn)輸?shù)降厥屑?jí)實(shí)驗(yàn)室的中位數(shù)為3d，線性探針檢測(cè)報(bào)告耐藥結(jié)果時(shí)間的中位數(shù)為20d，明顯低于傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間的中位數(shù)66d。線性探針檢測(cè)隨著工作熟練，檢測(cè)報(bào)告時(shí)間逐步縮短，最短為6d。

3 討論

耐藥結(jié)核病的早期診斷對(duì)控制耐藥結(jié)核病的傳播有重要意義。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足臨床需要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)涌現(xiàn)出很多方法用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)，基于PCR原理的線性探針?lè)椒ú僮骱?jiǎn)單，可以直接檢測(cè)涂陽(yáng)痰標(biāo)本，在一個(gè)工作日完成耐藥性檢惻，極大縮短了耐藥性報(bào)告時(shí)間[4]。

本研究采用臨床涂陽(yáng)結(jié)核病人的痰標(biāo)本作標(biāo)本，提取核酸DNA,PCR擴(kuò)增后，通過(guò)反相雜交檢測(cè)突變檢測(cè)耐藥性。研究結(jié)果顯示，LPA檢測(cè)利福平和異煙肼的靈敏度分別為86%和76%，檢測(cè)利福平和異煙肼的特異性分別為93%和95%，與李強(qiáng)等研究結(jié)果相似[5]。線性探針技術(shù)檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的敏感度達(dá)到70%，特異度達(dá)97%，準(zhǔn)確性為81%，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果充分表明，比例法和線性探針?lè)椒ㄔ跈z測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)RFP和INH的藥物敏感性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，線性探針技術(shù)檢測(cè)報(bào)告時(shí)間較傳統(tǒng)藥敏大為縮短，雖然線性探針技術(shù)操作可以在1個(gè)工作日完成，但是由于病人痰標(biāo)本需要從區(qū)縣運(yùn)輸?shù)降厥屑?jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)際上報(bào)告時(shí)間往往需要更多時(shí)間，研究結(jié)果顯示，線性探針平均檢測(cè)時(shí)間為20d，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)藥敏結(jié)果報(bào)告的66d。但隨著工作人員的操作熟練以及流程的熟悉，在研究后期線性探針報(bào)告時(shí)間縮短至6d，極大縮短了病人耐藥診斷時(shí)間，具有一定的臨床應(yīng)用和推廣價(jià)值。此外，我們的研究表明菌株凍存的時(shí)間不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可使用保存的菌株來(lái)開(kāi)展耐藥性檢測(cè)。需要注意的是，環(huán)境中的核酸可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境提出了更高的要求。

表1 兩種方法檢測(cè)耐多藥結(jié)核病的情況

表2 線性探針技術(shù)與比例法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性結(jié)果的比較

表3 線性探針技術(shù)與比例法檢測(cè)MDR TB結(jié)果的比較

表4 傳統(tǒng)藥敏和線性探針檢測(cè)時(shí)間比較

耐多藥結(jié)核病是當(dāng)前全國(guó)結(jié)核病控制的重點(diǎn)，快速耐藥診斷可以為耐多藥結(jié)核病人的早期治療提供科學(xué)依據(jù)，本研究結(jié)果顯示連云港市初診涂陽(yáng)肺結(jié)核病人中耐多藥率為15.77%，明顯高于全國(guó)水平。如果應(yīng)用新的快速耐藥檢測(cè)技術(shù)，將對(duì)本市未來(lái)耐多藥結(jié)核病控制具有重要意義。

[1]World Health Organization.Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis[S].WHO/TB,1996.

[2]World Health Organization/IUATLD.Global Working Group on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance[S].Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis.WHO/IUATLD,1997.

[3]Hillemann D,Weizenegger M,Kubica T,et al.Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates[J].J Clin Microbiol,2005,43:3699-3703.

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Research on line probe assay for rapid detection of MDR-TB

SHI Jinyan,LI Tiecheng,XIA Rongrong,et al.The Fourth People's Hospital of Lianyungang City,Jiangsu Lianyungang 222002,China

ObjectiveTo evaluate line probe assay on the detection of multi-drug resistant tuberculosis(MDR-TB)in clinical positive sputum specimens.MethodsA prospective case-control study was conducted to compare conventional drug susceptibility testing and line probe assay(LPA)by detection of rifampin(RFP)and isoniazid (INH)resistance in 326 clinical positive sputum specimens.The sensitivity and specificity of LPA were analyzed by comparing with conventional ratio drug sensitivity testing.ResultsThe sensitivity and specificity of LPA for MDR-TB detection was 70%and 97%,respectively.There was no significant difference between the two methods.The turnaround time of LPA was 20 days which was much shorter than that of traditional DST.ConclusionLine probe assay is a reliable simple method with high specificity and can be used for rapid detection of clinical MDR-TB.

Line probe assay;Multidrug resistance mycobacterium tuberculosis

R378.91+,R446.5

A

1674-1129(2012)04-0330-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.003

十一五國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2011ZX10004-902)

時(shí)金艷，女，1972年1月出生，畢業(yè)于江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管檢驗(yàn)師，研究方向：結(jié)核桿菌耐藥測(cè)序。

許衛(wèi)國(guó),Email:jsjkmcr@163.com