海南蒲桃果實(shí)原花青素的提取*

張鏡，刁樹平

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州，514015)

原花青素是一類天然自由基清除劑與抗氧化劑，具有抗輻射、抗突變，防癌、增強(qiáng)免疫、延緩衰老、改善腸道菌群等多種生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、功能性食品及化妝品等［1－6］。但生產(chǎn)原花青素的原料來源受季節(jié)與區(qū)域等的限制，產(chǎn)品供不應(yīng)求，價(jià)格昂貴。原花青素的研發(fā)雖逾半個(gè)世紀(jì)，而尋求原花青素含量高、原料成本低廉的植物資源，仍是天然活性產(chǎn)物研發(fā)的重要課題［7－9］。

海南蒲桃［S.cumini］，別名烏墨、楠木，是我國(guó)熱帶、南亞熱帶地區(qū)野生常綠喬木，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，對(duì)土壤要求不高，適宜在5～10 cm以上的沙壤土及表層為紅壤或黃壤土中生長(zhǎng)，并有火燒不死之稱［10］。海南蒲桃花多實(shí)豐，果實(shí)內(nèi)含多種成分，具有治療糖尿病、痢疾等疾病的藥用價(jià)值，鮮果生食對(duì)慢性咳嗽和哮喘有治療效果，是一種藥效很好的野生水果。我國(guó)華南地區(qū)海南蒲桃大量用于行道及水源涵養(yǎng)林種植。但海南蒲桃果實(shí)一直沒開發(fā)利用，大量海南蒲桃原花青素資源長(zhǎng)期廢棄。近年張亮亮等對(duì)海南蒲桃色素的提取及穩(wěn)定性［11－13］、黃思梅等對(duì)海南蒲桃果實(shí)原花青素抗氧化活性的穩(wěn)定性做了一定的研究［14］，本文研究了海南蒲桃果實(shí)原花青素的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要儀器

1.1.1 材料來源及預(yù)處理

于廣東梅州市采摘果皮顏色褪綠及淡紅色的八成熟海南蒲桃果實(shí)，除去過熟、果皮軟化的紫黑色果實(shí)以及傷果與雜物等，自來水洗凈、晾干，冷凍干燥，粉碎，80篩目過篩粉末低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇、濃鹽酸、硫酸鐵銨，均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

低速大容量多管離心機(jī)(JLL28-B)，上海安亭科學(xué)儀器廠;凍干機(jī)(BT2K XL)，美國(guó)VirTis公司;紫外-可見分光光度計(jì)(U-2800)，日本日立公司;酸度計(jì)(PHS-2C)，上海滬西分析儀器廠;電子分析天平(FA1604A)，上海精天電子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素提取效果與含量的測(cè)定

原花青素提取液定容后，以正丁醇-鹽酸法加熱顯色、測(cè)定各處理液A546值:取1 mL提取液于比色管中，依次加入6 mL體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液及0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液，沸水浴40 min，然后迅速冷卻，以蒸餾水代替樣液為參比，測(cè)定其A546值。以A546值為衡量提取效果的指標(biāo)，以文獻(xiàn)［15］公式計(jì)算原花青素的含量:

式中:A，吸光度;V，稀釋倍數(shù);m，樣品質(zhì)量(mg);0.366，在546 nm處原花青素的吸光度。

1.2.2 提取溶劑試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量海南蒲桃粉末，分別以不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇、丙酮及水為提取劑按1∶10(g:mL)的料液比，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，凍干后蒸餾水定容，得原花青素提取液，同1.2.1測(cè)定提取液A546值。

1.2.3 提取時(shí)間試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量海南蒲桃粉末，以60%丙酮為提取劑，料液比1∶10(g:mL)，室溫浸提至實(shí)驗(yàn)設(shè)定時(shí)間，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測(cè)定提取液A546值。

1.2.4 提取料液比試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量海南蒲桃粉末，以不同的料液比體積分?jǐn)?shù)與60%丙酮溶液混合，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測(cè)定提取液A546值。

1.2.5 提取液pH試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量海南蒲桃粉末，分別與不同pH值的60%丙酮溶液以料液比1∶10(g:mL)混合，室溫浸提2 h，4 500 r/min離心 20 min，收集上清夜，同1.2.1方法測(cè)定提取液A546值。

1.2.6 提取溫度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量海南蒲桃粉末，以料液比1∶10(g:mL)與60%丙酮提取劑混合，于10～70℃ 內(nèi)恒溫水浴中浸提2 h，4 500 r/min離心20 min，收集上清夜，3次重復(fù)，同1.2.1方法測(cè)定不同料液比原提取液的吸光度。

1.2.7 提取參數(shù)的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)溶劑濃度、pH值、料液比及提取溫度進(jìn)行4因素、3水平的正交優(yōu)化。

1.2.8 不同提取次數(shù)原花青素的提取率

以正交試驗(yàn)獲得的優(yōu)化參數(shù)提取八成熟果實(shí)物料原花青素5次，測(cè)定不同提取次數(shù)海南蒲桃原花青素的吸光度，以5次提取的吸光度總和為100%的提取率，然后計(jì)算不同提取次數(shù)原花青素的累計(jì)提取率。

1.2.9 果實(shí)不同成熟度原花青素的含量

八成熟度與充分成熟的海南蒲桃果實(shí)，冷凍干燥，粉碎，80篩目過篩，以正交優(yōu)化所獲參數(shù)提取的5次，同前述方法測(cè)定提取液A546值，計(jì)算原花青素的含量。

1.2.10 處理設(shè)置與數(shù)據(jù)分析

各處理重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值以excel作圖，用SPSS 11.0進(jìn)行方差分析，相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncans’差異顯著性分析，P＜0.0 5表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑與濃度提取原花青素的效果

海南蒲桃果實(shí)物料以4種溶劑室溫浸提原花青素2 h的相對(duì)效果見圖1。從圖1看出甲醇、乙醇及丙酮隨著濃度增加原花青素的提取效果相應(yīng)提高，達(dá)到一定濃度后提取效果又逐漸下降，但無水甲醇、乙醇及丙酮均無明顯的提取作用;60%溶液丙酮浸提的效果為最佳，70%溶液乙醇溶液其次，甲醇溶液的提取效果更差。供試的3種有機(jī)溶劑原花青素提取液最大的吸光度間差異極顯著(P＜0.01)。蒸餾水具一定的提取作用，但遠(yuǎn)低于含適宜比例有機(jī)濃度的提取效果。

圖1 溶劑種類及濃度對(duì)原花青素提取的影響

3種有機(jī)溶劑原花青素提取效果最佳的溶劑濃度不一。甲醇、丙酮與乙醇溶劑對(duì)原花青素提取效果最佳的濃度分別為50%、60%及70%，溶劑使用的濃度越高，提取過程中消耗的溶劑越多，提取費(fèi)用越大。但因60%丙酮提取的原花青素達(dá)50%甲醇溶液的1.55倍，與乙醇相比不僅溶劑消耗量低而且提取的效果好，因而丙酮作為提取溶劑為最適。

2.2 浸提時(shí)間與原花青素提取效果的關(guān)系

以60% 丙酮溶液為提取溶劑，室溫下不同時(shí)間原花青素的浸提效果見圖2。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)原花青素提取的影響

從圖2中可以看出，浸提時(shí)間在0.5～2.0 h內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)原花青素的溶出量逐漸增加，且2相鄰處理間提取液吸光度的差異顯著(P＜0.05)。浸提時(shí)間2.0～5.0 h內(nèi)提取液原花青素的吸光度存在小幅波動(dòng)，但彼此間差異不顯著。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下浸提2.0 h時(shí)物料中的原花青素的溶解已基本達(dá)到平衡，溶液中原花青素的量已達(dá)最大值。

2.3 料液比與原花青素提取效果的關(guān)系

海南蒲桃粉末與60%丙酮溶液以不同料液比(質(zhì)量/體積)混合，浸提2 h后的吸光度見圖3。結(jié)果料液比1∶4～1∶9內(nèi)隨料液比的增加，提取的原花青素量不斷增加，料液比1∶9原花青素的提取量與其它料液比提取的原花青素的差異顯著。結(jié)果表明，海南蒲桃原花青素以60%丙酮溶液浸提最適的料液比為 1∶9。

料液比的高低與提取液的極性無關(guān)，改變料液比不會(huì)改變目的物質(zhì)在溶液中的溶解度。但料液比的變化影響提取物的濃度與溶劑的使用量，溶劑若是使細(xì)胞膜溶解及膠體物質(zhì)變性而促進(jìn)目的物質(zhì)的溶出，則溶劑量越大對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用越大、膠性物質(zhì)沉淀越徹底，目的物質(zhì)越容易從胞內(nèi)擴(kuò)散至溶液。而且料液比越大，目的物質(zhì)胞內(nèi)與胞外的濃度差越大，目的物質(zhì)由胞內(nèi)向胞外擴(kuò)散的速度越快。

圖3 料液比對(duì)原花青素提取的影響

2.4 溶液pH值與原花青素提取效果的關(guān)系

不同pH值的60%丙酮溶液原花青素的浸提效果見圖4。

圖4 pH值對(duì)原花青素提取的影響

由圖4可見，pH=2時(shí)，原花青素的提取效果最好，提取液的吸光度分別為pH=1和pH=3提取液的1.16倍及1.67倍，而且與pH=1的差異顯著、pH=3差異極顯著。當(dāng)提取劑pH＞2時(shí)，提取原花青素的效果急劇下降，浸提液在pH在5～9內(nèi)原花青素提取液吸光度間的差異不顯著。結(jié)果表明酸性條件有利于海南蒲桃果核中原花青素的提取，弱酸、中性與強(qiáng)堿條件下對(duì)原花青素的提取效果均不佳，結(jié)果與原花青素提取相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道基本吻合［7］。

2.5 提取溫度對(duì)提取效果的影響

不同溫度浸提2 h提取液吸光度測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)原花青素提取的影響

結(jié)果表明，在50℃下提取對(duì)原花青素的提取效果最佳，提取液的吸光度為0.654，與40℃的提取液的吸光度差異極顯著，且與60℃下提取的提取液的吸光度差異顯著。提取溫度若較低，與蛋白質(zhì)、纖維素等結(jié)合的原花青素分離較慢，一定時(shí)間內(nèi)原花青素溶出少，提取效率不高;溫度升高，溶解速度加快，原花青素的提取率升高，而溫度過高可能影響原花青素的穩(wěn)定性差，聚合度降低、易氧化，得率低。植物活性物質(zhì)的提取多為50℃左右為宜［13］，也有少量以室溫浸提或沸水提取的報(bào)道［16］。

2.6 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以溶劑濃度、料液比、提取溫度及pH值進(jìn)行的L9(34)正交結(jié)果見表1。由表1可知各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序依次為料液比＞pH值＞提取溫度＞溶劑濃度。在提取時(shí)間為2 h條件下，提取海南蒲桃果實(shí)原花青素效果最佳的組合是A2B2C3D1，即提取的最佳參數(shù)為丙酮濃度60%、料液比1∶9、提取溶劑pH=3及提取溫度60℃，此提取參數(shù)使用的溶劑濃度與溶液的酸度較低，提取時(shí)間亦較短，但需要60℃的較高溫度。正交試驗(yàn)方差分析與顯著性檢驗(yàn)見表2。由表2可知，料液比對(duì)原花青素提取與丙酮濃度、pH值及提取溫度3因子相比的差異在顯著水，而后3者間的差異不顯著。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.7 提取次數(shù)與原花青素提取率的關(guān)系

海南蒲桃果實(shí)粉末以正交優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行5次原花青素提取，結(jié)果見表3。從表3可以看出，以正交優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行原花青素提取，經(jīng)1次提取的提取率為80.42%，2、3次提取的累計(jì)提取率分別為91.52%與95.29%，即經(jīng)3次浸提后殘?jiān)斜Ａ舻脑ㄇ嗨厣跷ⅰＱ芯勘砻鹘岽螖?shù)，以2～3次即可。

表3 不同提取次數(shù)原花青素的提取率

2.8 海南蒲桃果實(shí)原花青素的含量

八成熟與充分成熟的海南蒲桃果實(shí)以正交優(yōu)化參數(shù)分別進(jìn)行5次的原花青素提取后，測(cè)定其花青素含量(表4)。結(jié)果表明，八成熟的海南蒲桃果實(shí)的原花青素含量高，八成熟與充分成熟果實(shí)原花青素的含量分別為5.70%和4.48%。而且為充分成熟果實(shí)原花青素含量的127.23%，遠(yuǎn)高于充分成熟果實(shí)內(nèi)的原花青素含量。

表4 海南蒲桃果實(shí)原花青素含量%

3 結(jié)論與討論

研究表明從八成熟的海南蒲桃果實(shí)提取原花青素宜以體積分?jǐn)?shù)的60%的丙酮水溶液為提取溶劑、pH=3、料液比 1∶9、溫度 60℃、提取時(shí)間 2h，經(jīng) 2 次浸提原花青素提取率91.52%。丙酮溶液提取海南蒲桃原花青素的效果優(yōu)于乙醇及甲醇溶液，丙酮的酮基易于與原花青素中的羥基以氫鍵形式締合，在水溶液中兩者的氫鍵締合作用較強(qiáng)。文獻(xiàn)報(bào)道丙酮為溶劑提取原花青素的最佳濃度多為70% ～80%［17］，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是60%，溶劑消耗更少。

海南蒲桃果實(shí)原花青素開發(fā)宜以八成熟果實(shí)為原料。八成熟海南蒲桃果實(shí)原花青素的含量高，而且硬度大，采摘、干燥等中的損耗低。充分成熟果實(shí)中的部分原花青素轉(zhuǎn)化為花青素，并與糖結(jié)合形成花色苷［12］，但果實(shí)采摘、干燥時(shí)的損耗大，原料的利用率低。

海南蒲桃是開發(fā)活性產(chǎn)物的重要資源。八成熟海南蒲桃果實(shí)原花青素的含量達(dá)5.7%，而多數(shù)植物材料中原花青素含量不足1%。海南蒲桃是可鮮食的野生水果，果實(shí)中原花青素的安全性高。我國(guó)華南沿海省區(qū)海南蒲桃大量用于城市綠化與水源涵養(yǎng)林，開發(fā)海南蒲桃果實(shí)原花青素不僅可使資源變廢為寶，而且不影響其園林綠化與水源涵養(yǎng)功能。

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