BMP4/Smad4在C57BL/6小鼠內耳前庭發(fā)育不同階段的表達△

鄧安春 楊仕明 黃德亮 孫建和

哺乳動物內耳前庭末梢感受器包括三個半規(guī)管壺腹嵴和兩個囊斑，分別感受角加速度和直線加速度，這些功能和精細三維結構是在發(fā)育過程中不斷形成的。內耳前庭的發(fā)育是一個復雜的過程，從胚胎外胚層到聽板、聽囊，最后發(fā)育成熟，既包括外形的初步形成和改建，又包括各種上皮細胞的定向分化等。成年小鼠內耳感覺細胞種類、結構、功能、位置等的多樣性決定了其離不開多種影響因素的調控，多種基因在時間、空間上的精細、準確、重疊差異表達，使很少量的相同的胚胎外胚層細胞發(fā)育形成結構復雜功能多樣的內耳。利用基因敲除、基因打靶等分子生物學技術也證實大約有幾十種基因參與形態(tài)發(fā)育及感覺上皮定向分化的調控，但有關的詳細分子機制尚不清楚[1～3]，其中 BMP-Smad途徑被認為是最重要的一個。一般認為，BMP-Smad信號轉導是細胞定向分化的關鍵事件之一，各轉錄因子正是通過調節(jié)BMP-Smad信號轉導而參與內耳發(fā)育的調節(jié)[4～6]。但是，BMP-Smad在內耳前庭發(fā)育各個階段的分布、變化有待進一步闡明。為此，本實驗選用遺傳表型穩(wěn)定的C57BL近交系小鼠研究前庭發(fā)育過程中相關階段骨形態(tài)形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein 4)的表達。

1 材料與方法

1.1實驗動物與標本采集 挑選耳廓反應靈敏、健康的2月齡C57BL/6小鼠(北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供)，以雄：雌=1：2的比例作為種鼠，下午5點左右合籠，次日晨8點觀察母鼠陰道，若有陰栓，記為胚胎第一天(E1)，動物統(tǒng)一編號，統(tǒng)一飼養(yǎng)。選取從胚胎第10天(E10)到胚胎第20天(E20)每天的孕鼠各兩只，動物全部在上午8點處死，E10～E17時顳骨未鈣化，難以從頭顱中摘取內耳，故留取胚胎頭，E18～E20時顳骨鈣化，胚胎頭中的顳骨脫鈣困難，導致切片困難，故留取胚胎內耳。動物的使用獲得中國人民解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會的授權。

1.2主要方法與試劑

1.2.1冰凍切片 將留取的胚胎小鼠頭或胚胎小鼠內耳固定(4%多聚甲醛+2.5%戊二醛，4℃冰箱過夜)、脫鈣(10%EDTA，4℃冰箱48小時)、脫水(20%蔗糖溶液，過夜)、浸透及包埋(OCT液，過夜)，在包埋管中定位后于液氮液面冷氣急凍40秒，取出粘托，然后切片：胚胎頭平行于口-耳平面切片，內耳平行于蝸軸切片，均連續(xù)切片，片厚6 μm。鏡下看到壺腹嵴和囊斑時，間斷取片，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組化染色及免疫熒光檢測 兔來源Smad4抗體和羊來源的BMP4抗體均購自美國Santa Cruz生物技術公司。免疫組化按照試劑盒說明書操作，大致步驟包括：冰凍切片放至室溫、60℃烤箱烤片半小時后用蒸餾水洗去OCT、高壓抗原修復3分鐘、3%H2O2室溫孵育10分鐘消除內源性過氧化物酶活性、滴加封閉血清室溫孵育15分鐘、滴加一抗(1:100 PBS稀釋)4oC冰箱過夜、滴加生物素標記二抗37℃孵箱40分鐘、滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15分鐘、DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片后光鏡下觀察并采集圖像，分析各抗體表達的部位及強弱。

免疫熒光染色按照試劑盒說明書操作，大致步驟與免疫組化染色相同，只是二抗是熒光標記抗體(1:50 PBS稀釋)， 37℃孵箱1小時后防淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。羊抗兔Alexa fluor 488熒光標記二抗購自美國Molecular probes公司，SP-9003免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物工程技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物工程技術有限公司。

1.2.3免疫組化及免疫熒光結果判定 在40倍的物鏡下對發(fā)育過程中前庭部分的全部區(qū)域進行觀察，DAB染色陽性為棕色，熒光染色陽性為綠色熒光。記錄染色陽性的細胞數(shù)和染色的強度。以陽性細胞占觀察區(qū)域內前庭部分全部細胞的比例分為5級計分：0為<5%；1為5%～25%；2為26%～50%；3為51%～75%；4為>75%。染色的陽性強度按三級計分：1+為弱陽性；2+為中度陽性；3+為強陽性。每例染色的陽性細胞比例與染色強度相乘作為染色的加權計分值，該值>1為陽性，<1為陰性。

2 結果

2.1BMP4在小鼠內耳前庭發(fā)育不同階段的表達 從E10開始，小鼠內耳聽囊就有BMP4的陽性表達。E10和E11小鼠聽囊的上皮細胞里有較強的BMP4表達；E12時耳周間充質開始濃聚，聽囊變長且可分為明顯的前庭囊和耳蝸囊兩部分，BMP4主要表達在前庭囊以及前庭囊周圍濃聚的耳周間充質，這些濃聚的間充質將形成耳軟骨囊；E13時內耳進一步發(fā)育，BMP4在所有已出現(xiàn)的半規(guī)管、半規(guī)管壺腹、壺腹嵴、囊及囊斑里均有陽性表達，在軟骨囊的表達逐漸局限于半規(guī)管的背側及外側，中部前庭結構的外側耳周間充質；此后BMP4在小鼠內耳的表達越來越強，E14時與E13的表達類似，不過在軟骨囊里的表達范圍較E13時擴大，而且此時在耳蝸囊周圍的軟骨囊里也有BMP4的局部表達；到E15時基本與出生后的表達情況相當，不再發(fā)生變化，軟骨囊里BMP4的表達基本勾畫出內耳的大致形態(tài)。在感覺斑里，BMP4主要表達在感覺斑毛細胞的胞漿中，集中在靠囊腔的一側，胞核及支持細胞里也有BMP4陽性表達(圖1)。

2.2Smad4在小鼠內耳前庭發(fā)育不同階段的表達 從E10到E12，小鼠內耳沒有Smad4的表達；E13小鼠內耳在橢圓囊始基和半規(guī)管及半規(guī)管壺腹嵴始基的上皮細胞里有非常弱的Samd4表達，E14時比E13的表達略為增強；E15時各個壺腹嵴、囊斑里均有明顯的較強的Smad4表達，此時的表達主要局限在各感覺斑的上皮細胞里，而內耳周圍的軟骨囊此時還沒有Smad4的表達；到E16時，各感覺斑和軟骨囊里的Smad4表達與E19時相同，均為強陽性。感覺斑里的毛細胞、支持細胞均有Smad4表達，主要表達在毛細胞的胞漿中，核內較少，而支持細胞主要表達在胞核(圖2)。

3 討論

BMPs是TGF-β超家族的重要成員，在早期胚胎發(fā)育和器官形成的多個方面均有著多種不同的生物學活性[4]，其中BMP4與軟骨或骨發(fā)育的關系早已明確[5～8]，而且BMP4也影響內耳形態(tài)的形成[6，9，10]，本實驗結果與此一致，支持BMP4參與內耳形態(tài)形成的觀點。但是，BMP4在內耳前庭發(fā)育的哪個階段開始起作用的，目前不清楚。

內耳骨迷路是軟骨化骨而來，而內耳軟骨是耳周濃聚的間充質轉化而來。本研究發(fā)現(xiàn)，耳周間充質開始濃聚時就有BMP4的表達，具備了其參與耳周軟骨囊形成的條件，也就是說，在內耳前庭骨迷路發(fā)育剛被啟動時BMP4就可能開始起作用了。但BMP4并不是從一開始就包繞整個內耳，而是從局部表達開始，再逐步擴大，從文中結果看，開始主要位于半規(guī)管始基周圍，而且其在耳蝸囊周圍出現(xiàn)的時間明顯晚于其在前庭囊周圍出現(xiàn)的時間，這個過程可能正是耳周間充質向軟骨轉化的過程。正是由于這個過程的存在，各處軟骨囊形成的時間先后不一，需要BMP4的時間也先后不一，當BMP4基因剔出后，需要BMP4較晚的部位可能會激活其它的替代信號途徑，造成對小鼠內耳不同部位產(chǎn)生不同的影響[6，11]。

內耳膜迷路的發(fā)育起源于聽板，文獻報道BMP4早在聽板時期就有表達，對聽板的發(fā)育有影響[12，13]。本研究從聽板內陷形成聽凹繼而閉口形成聽囊后開始，結果提示BMP4的表達從E10開始直到成年，貫穿了小鼠內耳發(fā)育的整個過程，在內耳膜迷路有廣泛分布。其在E10聽囊上皮里的充分表達早于間充質濃聚的時間，說明其對膜迷路發(fā)育的作用與對骨迷路發(fā)育的作用是相對獨立的，不僅僅與內耳骨形態(tài)的形成有關，而且對膜迷路的形態(tài)形成可能也具有非常重要的作用。事實上，膜迷路大體形態(tài)基本形成以后，其周圍的軟骨囊才逐漸形成，也提示對軟骨囊發(fā)育的影響只能部分影響到內耳膜迷路的形態(tài)。

BMP4對內耳感覺上皮分化發(fā)育的作用目前沒有統(tǒng)一的意見，有些研究支持其參與毛細胞分化發(fā)育，有些研究卻與此相反[6，9，14～16]。本實驗結果及文獻[17]提示其在各感覺斑上皮細胞里均有表達，推測其參與了毛細胞的分化發(fā)育是合理的。其主要表達在毛細胞內，支持細胞內也有表達，提示其除了通過旁分泌作用影響上皮與上皮周圍中胚層組織之間的作用，參與內耳形態(tài)的發(fā)育之外，可能還參與了毛細胞、支持細胞的增殖及毛細胞的分化過程。其在毛細胞中主要位于胞漿靠腔面?zhèn)龋赡芘c其需要分泌到細胞外與胞膜上的受體作用后方可起作用有關。

圖1 BMP4在小鼠內耳前庭發(fā)育不同階段的表達從E10(a)開始，小鼠內耳就有BMP4的表達。E10(a)和E11(b)小鼠聽囊的上皮細胞里有較強的BMP4表達；E12(c、d)時聽囊變長且可分為明顯的前庭囊(VN)和耳蝸囊(CN)兩部分，BMP4主要表達在前庭囊以及前庭囊周圍濃聚的耳周間充質；E13時BMP4在所有已出現(xiàn)的半規(guī)管、半規(guī)管壺腹、壺腹嵴(f)、囊及囊斑(e)里均有陽性表達；到E15時(g～l)基本與出生后(m、n)的表達情況相當，不再發(fā)生變化，軟骨囊里BMP4的表達基本勾畫出內耳的大致形態(tài)。在感覺斑里，BMP4主要表達在感覺斑毛細胞的胞漿中，集中在靠囊腔的一側，胞核及支持細胞里也有BMP4陽性表達。標尺均為50 μm

圖2 Smad4在小鼠內耳發(fā)育不同階段的表達E10～E12 Smad4表達陰性(a、b、c)；E13小鼠內耳橢圓囊始基(d)和半規(guī)管及半規(guī)管壺腹嵴始基(e)的上皮細胞里有非常弱的Samd4表達； E15各個壺腹嵴(h)、囊斑(f、g)里均有較強的Smad4表達，主要局限在各感覺斑的上皮細胞里，但內耳周圍的軟骨囊(i)Smad4表達陰性；E16時各感覺斑(j、k)和軟骨囊(l)里Smad4表達與E19(m、n、o)時相同，均為陽性。表達在毛細胞的胞漿中，核內較少，而支持細胞主要表達在胞核。標尺為50 μm

Smads蛋白是BMP4受體復合物的下游信號調節(jié)蛋白，可將信號從細胞膜直接轉導至細胞核，從而對BMP4胞內信號轉導起著關鍵的作用。其中，Smad4作為BMP4信號傳導通路中的通用Smad，在細胞增殖、分化、移行、凋亡等過程中可能起著尤其重要的作用，從而參與內耳形成與感覺上皮分化的調控。理論上說，有BMP4出現(xiàn)的時間、區(qū)域就會有Smad4的存在。但是，本實驗發(fā)現(xiàn)從E10到E12，小鼠內耳沒有Smad4的表達，E13、E14也只有很弱的表達，這個發(fā)育階段里的BMP4只能通過非Smad信號途徑轉導，而且耳周軟骨囊里直到E16才有明顯的Smad4表達，此時BMP4在耳周軟骨囊里已基本將內耳輪廓勾畫出來。Smad4相對于BMP4的這種滯后表達的意義目前尚不清楚，有研究者推測Smad4在BMP信號轉導途徑中不一定具有中心地位[11，18]，也許BMP-Smad信號轉導途徑與輪廓早期形成的關系不大而是與其稍晚的外形修飾及功能發(fā)育有關。研究發(fā)現(xiàn)Smad4剔除后內耳輪廓基本完整但局部發(fā)生明顯畸形似乎支持這一推論[19]。

E13開始小鼠內耳有Samd4表達但很微弱，到E15時表達才比較明顯，且主要局限在壺腹嵴、囊斑，這與本實驗發(fā)現(xiàn)感覺斑里Myosin陽性毛細胞出現(xiàn)的時間一致(為本實驗的其他數(shù)據(jù)，即將在第三軍醫(yī)大學學報發(fā)表)，提示這二者間可能有某種聯(lián)系，可能BMP-Smad信號途徑在毛細胞的分化成熟中具有重要作用。Smad4基因剔除純合子(Smad4-/-)小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡，Smad4基因剔除雜合子小鼠(Smad4+/-)與野生型小鼠(Smad4+/+)相比，其聽力明顯下降，內耳毛細胞嚴重缺失[20～22]，似乎證明了這一點。

總之，本研究可以肯定BMP4、Smad4在內耳前庭發(fā)育中客觀存在，但BMP-Smad信號途徑在其中的作用并不明了。BMP4參與了內耳前庭形態(tài)的形成及感覺上皮的分化發(fā)育，而Smad4可能主要參與了發(fā)育后期的形態(tài)塑形和功能發(fā)育。

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