穩(wěn)心草黃酮類化合物對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響*

竇志強，戴恩來，薛國忠

(1.定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000;2.甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

穩(wěn)心草黃酮類化合物對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響*

竇志強1，戴恩來2，薛國忠3

(1.定西市人民醫(yī)院，甘肅 定西 743000;2.甘肅中醫(yī)學院，甘肅蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

目的：通過觀察穩(wěn)心草黃酮類化合物對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平變化的影響，探討其防治肺動脈高壓的物質基礎和作用機制，為中藥開發(fā)提供基礎研究資料。方法：穩(wěn)心草品種由藥學專家進行植物基源鑒定，穩(wěn)心草黃酮類化合物委托甘肅中醫(yī)學院科研中心提取并鑒定。用原代培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞，采用四氮唑藍比色法(MTT法)測定細胞增殖，采用放射免疫法檢測細胞外AngⅡ含量的變化。結果：穩(wěn)心草黃酮類化合物對體外培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞有抑制增殖的作用，與空白對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);穩(wěn)心草黃酮類化合物各劑量組AngⅡ含量低于空白對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且AngⅡ含量降低的程度與藥物劑量呈一定的正相關。結論：穩(wěn)心草黃酮類化合物對體外培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞有抑制增殖的作用，機制可能是其通過對AngⅡ的抑制，此可能是穩(wěn)心草黃酮類化合物具有一定的降低肺動脈高壓作用的原因之一。

穩(wěn)心草黃酮類化合物/藥效學;肺動脈平滑肌細胞/藥物作用;血管緊張素Ⅱ;細胞增殖;肺動脈高壓;細胞培養(yǎng)

肺動脈高壓是一類以肺血管阻力進行性升高為主要特征的疾病。大量研究證明：肺動脈高壓與肺血管結構重塑顯著相關。研究肺動脈平滑肌細胞增殖的機制，是探討低氧肺動脈高壓、慢性肺原性心臟病及其他血管疾病發(fā)生機制的重要方向;而抑制肺動脈平滑肌細胞增殖，成為治療低氧性肺動脈高壓的一個重要思路。AngⅡ為刺激血管平滑肌細胞遷移和增殖的強效收縮因子，對血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)遷移和增殖、促進新內(nèi)膜形成起重要作用。本實驗通過觀察穩(wěn)心草黃酮對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及血管緊張素Ⅱ的影響，為該藥治療肺動脈高壓提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

3月齡健康SPF級Wistar雄性大鼠20只，購于甘肅中醫(yī)學院SPF級實驗動物中心，質量(180±20)g，質量合格證號 SCXK(甘)2004－007－0001542。動物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，合格證號SYXK(甘)2004－006－0001597。

1.2 藥品、試劑與儀器

穩(wěn)心草，購自甘肅宕昌，經(jīng)甘肅中醫(yī)學院生藥學教研室李成義教授鑒定為正品;穩(wěn)心草黃酮類化合物，由甘肅中醫(yī)學院科研中心生藥研究室提取，該藥穩(wěn)心草總黃酮的含量是735 g/L。四氮唑藍(MTT)試劑，華美生物工程公司產(chǎn)品;十二烷基磺(硫)酸鈉(SDS)，購自蘭州鵬程生物公司;二甲基亞砜分析純，天津化工試劑廠產(chǎn)品;臺盼藍，購自北京中山生物技術有限公司;碘化丙啶PI，購自華美生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺(L-glutamine)、胰蛋白酶粉(1∶250)及Ⅱ型膠原酶，購自美國Gibco公司;新生牛血清，購自杭州四季青生物工程有限公司，批號060513;青霉素鈉，華北制藥廠產(chǎn)品，批號A051212006;鏈霉素，哈爾濱制藥六廠產(chǎn)品，批號050408;碘(125I)血管緊張素Ⅱ放射免疫分析藥盒，購自北京科美東亞生物技術有限公司。奧林巴斯IX71型倒置相差光學顯微鏡，日本Olympus公司;JEM－1230透射電鏡，產(chǎn)地日本;LKB-V超薄切片機，產(chǎn)地瑞典;XL型流式細胞儀，美國Coulter公司;RT2100型酶標儀，美國雷杜產(chǎn)品;DG－5031型酶標儀，國營華東電子管廠區(qū)產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng)

斷頸處死大鼠，以750 g/L乙醇浸泡消毒2 min;迅速分離取出肺動脈，以PBS液清洗去除血污，獲干凈光滑的管段;用眼科鑷固定血管段端，刀片輕刮去除外膜結締組織;用眼科剪小心剖開血管，刮去內(nèi)膜層細胞;將血管段剪成1 mm3大小的組織塊，均勻貼放于25 mL培養(yǎng)瓶底面，組織塊隙約2～3 mm;加入體積分數(shù)為20%的新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液2～3 mL，輕晃培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液掠過組織塊，翻轉靜置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中3～5 h;再次翻轉培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中，半開放式絕對靜置培養(yǎng)3 d;3～5 d時首次換液［7］;于第5～7天，在光鏡下觀察，有梭形的細胞從組織塊邊緣長出;于第10～12天長成密集的不均勻的單層或多層細胞。

1.4 實驗分組

分藥物組和空白對照組6組：藥物組分別加入不同劑量的穩(wěn)心草黃酮，空白對照組加入等量的PBS。

1.5 檢測指標

1.5.1 肺動脈平滑肌細胞

采用增殖四氮唑藍比色法(MTT法)測定。取處于對數(shù)生長期的大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)，鏡下觀察細胞長勢良好。用移液器吸去培養(yǎng)液，加入PBS緩沖液液3 mL清洗細胞兩次;加入1.25 g/L胰蛋白酶消化液2～3 mL，置于倒置相差光學顯微鏡下觀察;待細胞回縮，細胞間隙增大時翻轉培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶脫離細胞，吸除消化液，加入含體積分數(shù)為10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液4～6 mL終止消化，并輕輕吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，臺盼藍排斥試驗測定細胞活力，鏡下細胞計數(shù)細胞活力在95%以上。將細胞混懸液移入離心管以2000 r/min離心10 min，細胞計數(shù)調整為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。每板接種5個不同藥物劑量的藥物組和1個空白對照組，共6個組。每組設6個復孔，每孔加入90 μL細胞懸液，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2常氧細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，待細胞生長基本匯合后小心吸除孔中培養(yǎng)液及藥物;各藥物組分別在細胞培養(yǎng)液中加入不同劑量穩(wěn)心草黃酮類化合物10 μL，空白對照組在細胞培養(yǎng)液中加入等量的PBS，調零孔只加等量的培養(yǎng)液(無細胞)，全濕條件下，37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于加藥后24，48，72及96 h在各孔加入MTT 10 μL;繼續(xù)培養(yǎng)4 h，分別在各孔中加入100 μL十二烷基硫酸鈉(SDS)終止培養(yǎng);12 h后，待結晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處的吸光度(OD)值，按下式計算細胞抑制率。

1.5.2 AngⅡ含量

①原理：采用液相競爭放射免疫分析法，直接測定血漿中血管緊張素Ⅱ的含量。先將校樣品(或樣品)、標記物和抗體按操作程序依次加入試管中，使標記和非標記抗原與有限量抗體互相競爭結合，待反應平衡后，加入分離劑，離心沉淀，使游離抗原與抗原抗體復合物分離，測定沉淀物的放射強度。隨AngⅡ含量增加，其放射性強度則相應降低。

②方法：采用放射免疫法檢測。將圓底聚苯乙烯試管編號(復管)，按碘(125I)血管緊張素Ⅱ放射

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標準差(s)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析和q檢驗。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 穩(wěn)心草黃酮類化合物對PASMC增殖的影響

穩(wěn)心草黃酮類化合物50 mg/L抑制肺動脈平滑肌細胞增殖的作用不明顯，隨著劑量的增大，穩(wěn)心免疫分析藥盒上的加樣測定程序表方法操作，操作要求在冰水浴中進行。數(shù)據(jù)處理：以B/B0為縱坐標，以校準品濃度為橫坐標，在Logit－Log坐標紙上繪制校準曲線，根據(jù)樣品B/B0，從校準曲線上查出樣品的含量，用自動r計數(shù)儀預先編制的程序直接給出有關參數(shù)、校準曲線及樣品濃度。草黃酮類化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h，均有抑制PASMC增殖的作用;從抑制率看，藥物濃度與抑制PASMC增殖程度成正相關。比較同一劑量下，穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的抑制率結果，提示穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h時其抑制平滑肌細胞增殖的效果最明顯，抑制率為23.48%。見表1～2。

表1 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h的MTT 結果分析 n=6，±s

表1 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 48 h的MTT 結果分析 n=6，±s

注：與空白對照組對比，*P ＞0.05，＊＊ P ＜0.05。

組 別8 h A 抑制率/%空白對照組0.400 ±0.023 0.00穩(wěn)心草黃酮類化合物50 mg·L －1組 0.394±0.027* 1.51穩(wěn)心草黃酮類化合物100 mg·L －1組 0.377±0.039* 5.75穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L－1組 0.340±0.033＊＊ 15.12穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L－1組 0.327±0.045＊＊ 18.25穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L －1組 0.313±0.015＊＊21.75

表2 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的MTT結果分析 n=4，±s

表2 穩(wěn)心草黃酮類化合物作用于PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的MTT結果分析 n=4，±s

注：與空白對照組對比，＊＊ P＜0.05。

組 別/%正常對照組 0.396 ±0.124 0.00 0.553 ±0.027 0.00 0.693 ±0.0 24 h A 抑制率/%48 h A 抑制率/%72 h A 抑制率/%96 h A 抑制率37 0.00 0.817 ±0.051 0.00穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L －1組 0.345±0.018＊＊ 12.96 0.465±0.030＊＊ 15.93 0.604±0.026＊＊ 12.93 0.752±0.026 8.01穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L －1組 0.339±0.043＊＊ 14.38 0.448±0.015＊＊ 19.01 0.576±0.035＊＊ 17.03 0.745±0.044 8.87穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L －1組 0.329±0.033＊＊ 17.05 0.423±0.049＊＊ 23.48 0.560±0.028＊＊ 19.27 0.732±0.036＊＊10.42

2.2 穩(wěn)心草黃酮類化合物對細胞外AngⅡ含量的影響

與空白對照組對比，穩(wěn)心草黃酮類化合物各劑量組AngⅡ含量降低，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結果顯示：AngⅡ降低的程度與藥物劑量呈正相關。見表3。

表3 穩(wěn)心草黃酮類化合物對細胞外AngⅡ含量的影響n=5± s

表3 穩(wěn)心草黃酮類化合物對細胞外AngⅡ含量的影響n=5± s

注：與空白對照組對比，＊＊ P＜0.05。

組 別 AngⅡ含量/(μg·L－1)正常對照組＊＊402.31 ±47.24穩(wěn)心草黃酮類化合物200 mg·L－1組 334.68 ±23.51＊＊穩(wěn)心草黃酮類化合物400 mg·L－1組 261.33 ±20.29＊＊穩(wěn)心草黃酮類化合物800 mg·L－1組 211.40 ±15.54

3 討論

肺動脈高壓的多表現(xiàn)于中醫(yī)學“肺脹”的全過程中，肺脹由多種慢性肺系疾病轉歸而成。肺動脈高壓臨床表現(xiàn)為胸部膨滿，脹悶如塞，喘咳上氣，痰多，煩躁、心慌，甚則見唇甲紫紺。病久可見面色晦暗，面唇紫紺，脘腹脹滿，肢體浮腫，甚或昏迷、抽搐以至喘脫等危重癥候。根據(jù)其癥狀表現(xiàn)與中醫(yī)學“咳喘”“痰飲”“心悸”“水腫”“喘厥”等證有關。病因肺為華蓋之臟，邪氣首先犯肺，肺失宣降，發(fā)為肺病;久病肺虛為主，由于反復感邪，使病情進行性加重。病位在肺，日久不愈，反復發(fā)作，正氣必衰，進而累及脾、腎、心等臟俱虛，可出現(xiàn)肺脾腎陽氣衰微，氣不化水，水飲凌心射肺而引起咳喘或喘脫及水腫。病理性質多由氣虛、氣陰兩虛發(fā)展為陽虛，在病程中且可形成痰、飲、瘀等病理產(chǎn)物。臨床常見痰濁壅肺、痰熱郁肺、痰蒙神竅、肺腎氣虛、陽虛水泛等5個證候，各證常可互相兼夾轉化。肺氣的宣降失常、痰飲內(nèi)生、瘀血阻滯是肺動脈高壓形成并伴隨疾病全過程的基本病理機制。以肺脹來代替肺動脈高壓加以討論是比較合適的。目前肺動脈高壓病理生理復雜，故其防治尚未取得突破性進展。

穩(wěn)心草(Hypericum attenuatumChoisy.)，又名趕山鞭、黑點葉金絲桃［1］，為藤黃科金絲桃屬植物，是民間常用的中草藥，常用于心臟病的治療［2］。有研究［3］證實：穩(wěn)心草在改善慢性克山病患者癥狀的同時，還對肝臟腫大、浮腫、頸靜脈充盈有一定效果，從而使心功能獲得不同程度的好轉。穩(wěn)心草的化學成分主要為黃酮類化合物。顧麗貞等［4］測定全草中黃酮類化合物含量平均為1.67%，董建勇等［5］對從甘肅產(chǎn)穩(wěn)心草的地上部分分離出了11種黃酮化合物。國內(nèi)外學者［6］發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物有多種藥理作用，包括：①清除自由基、抑制細胞膜脂質過氧化，降低過氧化脂質含量、提高紅細胞超氧化物歧化酶活性。②對心肌缺血引起的心功能紊亂有保護作用，增加冠脈血流及頸動脈流量，抗心肌及腦缺血。③防止血栓形成和抗血小板聚集。④抑制血管平滑肌細胞增殖和細胞外基質沉積。⑤降低血三酰甘油酯和提高高密度脂蛋白的含量。

本結果顯示：穩(wěn)心草黃酮類化合物在劑量較大時對肺動脈平滑肌細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性，藥物的最佳作用時間為48 h，此時抑制率為23.48%。穩(wěn)心草黃酮類化合物能降低肺動脈平滑肌細胞外AngⅡ水平，兩者呈正相關。此可能是其降低肺動脈高壓的基礎因素之一。

本研究為穩(wěn)心草黃酮類化合物具有抑制肺動脈平滑肌細胞增殖提供了一定的實驗依據(jù)，并為開發(fā)治療肺動脈高壓的中藥新藥提供了基礎研究資料。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第五十卷第二分冊［M］.北京：科學出版社，1990：69.

［2］江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典：下冊［M］.上海：上海人民出版社：1823.

［3］黑龍江省呼倫貝爾盟地方病防治研究所.穩(wěn)心草對慢性克山病初步治療觀察［J］.黑龍江醫(yī)藥，1976，3：46 －48.

［4］顧麗貞，張宏彬.穩(wěn)心草化學成分的研究［J］.植物學報，1980，22(2)：151.

［5］董建勇，賈忠建.趕山鞭中黃酮類化學成分研究［J］.中國藥學雜志，2005，12(40)：897 －899.

［6］劉文麗，于魯海，馬燕.紫外分光光度法在黃酮類化合物含量測定中的應用［J］.新疆中醫(yī)藥，2006，24(3)：85 －86.

1001－6910(2012)09－0055－04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.029

戴恩來，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：daienlai@sohu.com

甘肅省自然科學基金暨中青年科技基金項目(編號ZS031－A25－077－E)

2011－12－05;

2012－04－05

(編輯 陶 珠)

·學術探討·