小鼠Reelin 基因啟動子克隆鑒定及生物信息學分析*

張建軍 姜樹原 張顏波 吳松泉 牛敬忠 邵 國

(1. 鄂爾多斯市康巴什新區(qū)醫(yī)療急救中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000；2.包頭醫(yī)學院生物醫(yī)學研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010； 3.包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；4. 泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000；5.麗水學院醫(yī)學院，浙江 麗水 323000)

Reelin是與細胞外基質(zhì)相關(guān)的巨大的糖蛋白，它在誘導海馬突觸可塑性中具有獨特的作用，正常水平的Reelin對于成熟大腦的記憶形成是必需的[1]，因此Reelin被眾多的研究小組作為研究學習記憶的重要指標[2-3]。Reelin基因于1995年被克隆，鼠Reelin是非常大的一個基因，它有65個外顯子，在基因組上跨度達到450 kb，Reelin的mRNA有12 kb長，其全長的表達產(chǎn)物有400 KDa大小[4]，它還有300 KDa和180 KDa兩種斷裂產(chǎn)物[5-6]。Reelin的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游的promoter區(qū)(G+C)含量非常之高，達到75%[4]，而Reelin的promoter區(qū)甲基化的改變可以影響其表達[7-8]。本研究利用高保真PCR克隆了小鼠Reelin基因的啟 動子區(qū)并分析了其甲基化情況及潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，為進一步構(gòu)建特異表達載體及進一步研究甲基化對其轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料 昆明小鼠，Expand High Fidelity PCR System(Roche公司)，EZ DNA Methylation-Gold Kit(zymo公司),rTaq(Takara公司)，基因組DNA提取試劑盒(康為世紀)，TA clone kit(invitrogen)，DH5α 菌種等。

1.2引物設計 根據(jù)小鼠Reelin基因上游序列設計引物，Reelin-F: GGCCTGACTGGAAAGGGCTCG；Reelin-R: AAAGTGCCCGCCCCCTCC。預期擴增產(chǎn)物為450 bp。

1.3提取基因組DNA，PCR 擴增、T-A 克隆及測序 根據(jù)基因組提取試劑盒說明提取小鼠大腦中基因組DNA，將提取的基因組DNA用RNA酶消化后凍存?zhèn)溆?。?.5 μg基因組DNA作為模板，利用Expand High Fidelity PCR System進行擴增，擴增條件為94℃變性5 min; 94℃、30 s, 52℃、30 s, 72℃、30 s, 30個循環(huán); 72℃延伸8 min。擴增結(jié)束后，加入rTaq及dNTP，72℃保溫10 min，使PCR產(chǎn)物加上A。取1 μl PCR 產(chǎn)物，2 μl PCR-2.1載體在T4 DNA連接酶作用下連接16 h。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH 5α細菌，通過藍白斑篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定質(zhì)粒，對含正確插入片斷的質(zhì)粒測序。

1.4Reelin啟動子區(qū)DNA甲基化情況分析 如1.3方法提取基因組DNA，使用EZ DNA Methylation-Gold Kit將5-mC轉(zhuǎn)變成T，取1 μl產(chǎn)物為模板，正向引物：ATTACAACCRATATAAACAAAAAACAA；反向引物：AAGTTAGTGGGAGATYGAGGTTTT，擴增區(qū)域為轉(zhuǎn)錄起始點(-636bp～-135bp)區(qū)域。加入rTaq及dNTP進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物如1.3進行TA克隆和測序。

1.5Reelin啟動子區(qū)DNA甲基化位點及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析 利用ABI公司的Methyl Primer Express software V1.0軟件，對克隆的序列進行CpG位點分析。利用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測軟件TFSEARCH對Reelin啟動子序列的特征性分析。

2 結(jié) 果

2.1小鼠Reelin啟動子克隆及鑒定 以人基因組為模板，通過特異性上游引物和下游引物進行PCR擴增，擴增后加上A后與PCR 2.1載體經(jīng)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌。藍白斑篩選挑取單克隆，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小,可獲得0.45 kb左右和3.9 kb 左右2個目的片段(圖1)。表明目的片段已插入到表達載體。將酶切正確克隆送公司測序，測得序列與Genbank登記的人Reelin基因啟動區(qū)完全相同即為正確的質(zhì)粒(圖2)。

2.2小鼠Reelin啟動子區(qū)(-636 bp～-135 bp)DNA 甲基化狀態(tài) 通過Bisulfite處理基因組后使5-mC轉(zhuǎn)換成T，通過測序分析發(fā)現(xiàn)在PP1啟動子區(qū)(-636 bp～-135 bp)沒有CpG二核苷酸被甲基化，結(jié)果顯示小鼠Reelin啟動子區(qū)(-636 bp～-135 bp)處于非甲基化狀態(tài)。

2.3小鼠Reelin啟動子DNA甲基化位點分析 Methyl Primer Express software V1.0軟件分析結(jié)果顯示(圖3)，在小鼠啟動起始點上游450 bp，G+C含量高達78.71%，CpG含量為14.44%，符合CpG島特征，是潛在的DNA甲基化位點。

圖1 PCR2.1-小鼠Reelin啟動子區(qū)質(zhì)粒EcoRI酶切電泳圖

圖2 PCR2.1-小鼠PP1啟動子區(qū)質(zhì)粒Blast結(jié)果

圖3 Methyl Primer Express software V1.0分析Reelin啟動子區(qū)

2.4小鼠Reelin啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析 啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始位點上游的450 bp 區(qū)域內(nèi)含有大量的順式調(diào)控元件，啟動子附近可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子主要有: ADR1、 HSF、MZF1等。其中以ADR1 的結(jié)合頻率最高，含有36個潛在結(jié)合位點。

3 討 論

Reelin 蛋白在大腦發(fā)育過程中有著關(guān)鍵作用，Reelin基因表達異常與人類精神分裂有關(guān)，其5'非翻譯區(qū)與其轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控有密切關(guān)系[9]。小鼠ATG上游280 nt和298-299 nt有兩個轉(zhuǎn)錄起始點，ATG上游500 nt的G+C含量相當高[4]。啟動子區(qū)的甲基化可以影響基因表達調(diào)控，精神分裂癥患者Reelin啟動子高甲基化使得其表達下降[8]。作為哺乳動物大腦中具雙重角色的可分泌絲氨酸蛋白酶的糖蛋白Reelin：胚胎發(fā)育過程中，引導神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細胞到達正確位置;在成人的大腦，Reelin的信號通路參與神經(jīng)傳導的基礎，記憶的形成和突觸可塑性。通過突變和選擇性的高甲基化Reelin基因啟動子干擾Reelin的信號轉(zhuǎn)導通路可能會導致神經(jīng)精神障礙，如自閉癥或精神分裂癥的認知功能障礙[10]。

本研究克隆了小鼠Reelin基因啟動子區(qū)上游450 bp 的片段，該區(qū)域富含G+C，G+C高達79%以上，同時CpG含量達到14%以上，軟件分析其符合CpG島特征。我們將該片段克隆到了PCR2.1載體上，該載體上有多克隆位點，容易將該片段亞克隆到pGL-3 basic中，為體外進一步研究其功能奠定了基礎。在Reelin起始密碼上游-636 bp～-135 bp范圍內(nèi)，沒有CpG二核苷酸被甲基化，表明常氧情況下該區(qū)段是處于非甲基化的。在Reelin啟動區(qū)上游450 bp范圍內(nèi)，有潛在的轉(zhuǎn)錄因子107個，其中ADR1的頻率最高，達到了36個。USF結(jié)合位點為16個，SP1結(jié)合位點為13個，HSF結(jié)合位點為10個。我們克隆了該翻譯起始點上游450 bp片段，并且分析了轉(zhuǎn)錄因子位點，為進一步通過定點刪除來研究功能等奠定了基礎。

Reelin是與學習記憶密切相關(guān)的蛋白，其表達與學習記憶能力相關(guān)。有報道低氧可以改變DNA甲基化狀態(tài)[11]，我們先前研究低氧預適應可以提高小鼠學習記憶能力[12]，本工作為進一步探討低氧預適應提高小鼠學習記憶能力的研究奠定了基礎。

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