抗MRSA-PBP2a雞卵黃抗體的制備及乳膠凝集檢測法的建立

鄒玖明，張愛平，李智山*

(1.襄樊學(xué)院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院檢驗科，湖北襄陽441021;2.襄陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北襄陽441021)

雞卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)是雞血液中IgG抗體選擇性轉(zhuǎn)移到卵黃中形成的，是卵黃中唯一的免疫球蛋白類。其形成、生物學(xué)特性等方面已研究得較清楚，并且作為診斷試劑和防治藥物的研究正越來越受到關(guān)注。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)是導(dǎo)致社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)獲得性感染最重要的致病菌之一，在世界范圍內(nèi)廣泛流行［1］。其主要耐藥機(jī)制是由mecA基因編碼產(chǎn)生了對β-內(nèi)酰胺類抗生素低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)，因此檢測PBP2a抗原是鑒定MRSA的一個可靠方法［2］。本研究采用體外誘導(dǎo)方法制備PBP2a蛋白作為抗原免疫海藍(lán)雞，旨在制備高效價、特異的抗PBP2a雞卵黃抗體，并建立檢測MRSA的乳膠凝集方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料24周齡的健康海藍(lán)蛋雞8只購于湖北宜昌市種雞廠，6只進(jìn)行免疫，2只用作陰性對照。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ATCC706986，MRSA)、甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(ATCC25923，MSSA)、金黃色葡萄球菌(ATCC25922、ATCC29212、ATCC27853)均為本室保存。

1.1.3 試劑LB培養(yǎng)基(上海生工)、PBS緩沖液(上海生工)、頭孢唑肟(英國OXOID)、溶葡萄球菌素(SIGMA)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(SIGMA)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞Gig(美國Pierce)、酶標(biāo)反應(yīng)板、硝酸纖維素膜(BIORAD)。

1.2 方法

1.2.1 PBP2a蛋白的誘導(dǎo)及制備參照文獻(xiàn)［3］方法:取隔夜培養(yǎng)的MRSA 5～10個菌落接種于300 mL液體LB培養(yǎng)基中，加入0.2 g/mL頭孢唑肟作為誘導(dǎo)劑，32℃振搖培養(yǎng)18 h后，10 400 r/min離心10 min，50 mmol/L PBS緩沖液洗滌1次，分裝試管中，每支終體積為3 mL，然后加入50 μg/mL溶葡萄球菌素，32℃孵育30 min，超聲粉碎細(xì)菌，8 700 r/min 4℃低溫離心10 min，棄底部未粉碎細(xì)菌，104 000 r/min 4℃低溫再離心60 min，取上清液進(jìn)行100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后回收電泳條帶中目的蛋白，充分研磨粉碎后用0.22 μm濾器過濾，BCA法測定濾液中蛋白含量，將其濃度調(diào)為1 mg/mL備用。

1.2.2 母雞免疫及卵黃抗體制備以獲得的PBP2a蛋白和等量完全弗氏佐劑混合，充分研磨乳化后作為抗原免疫25周齡海藍(lán)母雞，免疫方法:首次免疫劑量為100 μg/只，然后改用弗氏不完全佐劑和重組蛋白等量混合，15 d后進(jìn)行第2次免疫，劑量為200 μg/只，之后分別隔1月進(jìn)行第3次免疫和加強免疫，劑量均為300 μg/只，免疫方式為胸部肌肉多點注射。第2次免疫后1周開始收集雞蛋于4℃保存?zhèn)溆茫瑫r留取免疫前的雞蛋作為對照。卵黃抗體的提取參照文獻(xiàn)［4］方法:用0.05 mol/L(pH 5.0)的乙酸-乙酸鈉緩沖液，將卵黃液進(jìn)行9倍稀釋，4℃過夜靜置分層取上清，10 400 r/min離心20 min，取上清液，用飽和硫酸銨鹽析沉淀，除去上清液，將沉淀透析除鹽，定容5 mL，BCA法測定蛋白含量，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 IgY特異性鑒定采用Western blotting分析鑒定。將純化的PBP2a蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用1%的脫脂奶粉4℃封閉過夜。一抗為免疫后的IgY(濃度為1∶1 000)，免疫前雞蛋的原有IgY作為對照;二抗為羊抗雞HRP-IgG(濃度為1∶100 000)，用4-氯-1-萘酚+3%H2O2顯色。

1.2.4 乳膠凝集試驗乳膠致敏方法參照文獻(xiàn)［5］。將純化的PBP2a蛋白按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶5 000 5個濃度稀釋，每個稀釋濃度取50 μL加于反應(yīng)卡片上，然后滴加25 μL抗PBP2a卵黃抗體致敏的乳膠懸液，輕搖卡片使其混合均勻，3 min后觀察結(jié)果，同時以生理鹽水及未致敏的乳膠懸液作為對照。細(xì)菌凝集前處理:分別挑取隔夜培養(yǎng)的ATCC706986、ATCC25923、ATCC25922、ATCC29212、ATCC27853加入5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液配制成0.5 Mc濁度，煮沸3 min，冷卻至室溫，加入0.5 mol/L KH2PO4中和，4 000 r/min離心5 min，最后用10%三氯乙酸濃縮備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)的PBP2a蛋白

將體外誘導(dǎo)的PBP2a蛋白行100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在分子量78 ku處出現(xiàn)明顯條帶，與理論分子量一致，對照菌株ATCC25923未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1)。

圖1 PBP2a蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of purified PBP2a protein

2.2 IgY蛋白含量的測定

提純后IgY的蛋白濃度約為5 mg/mL。每只雞蛋經(jīng)鹽析、透析和濃縮后可以得到48 mg的IgY。

2.3 Western blotting檢測

Western blotting結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的PBP2a抗原可被免疫后的IgY識別，而與未免疫的IgY不發(fā)生反應(yīng)(圖2)。

圖2 IgY的Western blotting分析Fig.2 Western blotting analysis of IgY

2.4 乳膠凝集試驗

乳膠凝集結(jié)果顯示，致敏乳膠試劑能夠與純化的PBP2a蛋白、MRSA菌體蛋白提取液發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，而在ATCC25923、ATCC25922、ATCC29212、ATCC27853菌體蛋白提取液、生理鹽水未見凝集出現(xiàn)。其檢測純化PBP2a蛋白的敏感性達(dá)1 mg/L;對不低于其檢測敏感性含量的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)測定，穩(wěn)定性良好。未致敏的乳膠懸液與上述PBP2a蛋白及各種菌體蛋白提取液均不發(fā)生凝集反應(yīng)。

3 討論

近年來，MRSA引起的院內(nèi)感染不斷上升，嚴(yán)重感染患者病情復(fù)雜、死亡率高。因此快速準(zhǔn)確診斷MRSA感染對于及時合理的治療和有效的感染監(jiān)控具有重要的意義。膠乳凝集法直接檢測耐藥蛋白PBP2a，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是鑒定MRSA的有效方法。目前使用的PBP2a檢測試劑盒中的單抗均為IgG來源，其制備繁瑣，價格昂貴，難以普及使用。

IgY相對于IgG抗體具有顯著的優(yōu)點:性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐熱能力強，而且制備上所需免疫抗原劑量小，獲得的抗體均一性好，特異性強，能避免干擾現(xiàn)象，減少假陽性發(fā)生［6］。Di lonardo等［7］發(fā)現(xiàn)在Western印跡和免疫沉淀反應(yīng)中，IgY比IgG能更有效地識別抗原表位，在免疫細(xì)胞化學(xué)法上只有IgY能在HPV16陽性的細(xì)胞中特異性地定位轉(zhuǎn)運蛋白E7;De-Almeida CM等［8］制備了致病性大腸埃希菌(EPEC)菌毛中結(jié)構(gòu)重復(fù)蛋白A亞單位(BfpA)的IgY用于免疫吸附，發(fā)現(xiàn)IgY可以特異性地鑒定EPEC。因此，IgY在免疫學(xué)檢測方面具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

本研究采用體外誘導(dǎo)PBP2a蛋白加福氏佐劑的方法免疫海藍(lán)雞，獲得高純度的抗PBP2a蛋白的IgY抗體。Western印跡法對IgY抗體的特異性進(jìn)行了分析，證明所制備的抗體能和PBP2a抗原特異性結(jié)合，乳膠凝集結(jié)果顯示IgY抗體致敏乳膠試劑能夠與純化的PBP2a蛋白、MRSA菌體蛋白提取液發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，而與MSSA、ATCC25922、ATCC29212、ATCC27853等菌體蛋白提取液沒有交叉凝集。其檢測靈敏性達(dá)到1 mg/L，可作為理想的檢測抗體應(yīng)用于臨床，也為進(jìn)一步研制廉價易得的MRSA快速鑒定試劑盒奠定了很好的基礎(chǔ)。

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