慢性乙型肝炎病毒耐藥突變體研究

陳俊意，朱照靜，張如超，楊治國(guó)，蔣洪輝，鄧才彬，譚麗，黃曉可

(重慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校重慶醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所/臨床醫(yī)學(xué)系，重慶400030)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原體［1-5］，由HBV所引起的乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的傳染病。我國(guó)慢性乙肝病毒感染者占全世界的1/4，拉米夫定(lamivudine)和阿德福韋雙酯(adefovir dipivoxil)是目前廣泛用于治療慢性乙型肝炎的核苷類(lèi)似物藥物，這2種藥物可以在單一治療或在聯(lián)合治療中使用。但由于耐藥HBV病毒株的出現(xiàn)，治療效果常常不能持久。有些患者在治療中或治療后觀察到肝炎突然發(fā)作，可再次檢測(cè)到HBV DNA，使得乙型病毒性肝炎治療成功率一直不高［6-10］。臨床研究表明，用于臨床治療的核苷(酸)類(lèi)似物產(chǎn)生的耐藥是由于HBV發(fā)生了突變，進(jìn)而導(dǎo)致藥物抑制病毒復(fù)制的作用明顯減弱。因此在新的抗病毒藥物投入臨床使用之前，對(duì)HBV耐藥突變體進(jìn)行篩選，對(duì)耐藥的分子機(jī)制進(jìn)行研究，變得更加迫切。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例重慶腫瘤醫(yī)院40歲男性患者1名，HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性，該患者以前未接受抗病毒治療，入院后用抗病毒核酸類(lèi)藥物治療。最開(kāi)始用拉米夫定治療16周，而后用拉米夫定和阿德福韋混合治療16周。

1.1.2 血清收集和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定分別于0、18、22、60和70周收集患者血清。測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamate-pyruvate transaminase，ALT)及HBV DNA滴度，均利用商業(yè)試劑盒按照臨床要求測(cè)定。直接測(cè)序確定HBV基因型。

1.2 方法

血清中HBV DNA提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(Omega，America)進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積30 μL，20 mmol/L Mg2+3 μL、2 mmol/L dNTP 3 μL、10×buffer 3 μL、引物3 μL、模板3 μL、Tag酶0.2 U，用去離子水(DH2O)補(bǔ)足體積。用一對(duì)外引物(P1、P2)進(jìn)行第1輪PCR，P1為5'-AAGGGTATCTTGCCCGTTTGTCGTA-3'，P2為5'-AAGCAGGATAGCCACAGA-3'，擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s，36個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min，第1輪產(chǎn)物為模板，以引物P3(5'-AAGGCACTTGTATTCCCATCCGAG-3')和P4(5'-AAGGTCTATTTACAGGGGA-3')進(jìn)行第2輪PCR。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸5 min。最后將PCR產(chǎn)物分別在3%瓊脂糖中進(jìn)行電泳，同時(shí)加入Marker通過(guò)產(chǎn)物片段的大小來(lái)判斷基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 患者血清HBV的DNA滴度測(cè)定

慢性乙肝病毒感染者血清HBV的DNA滴度是反映HBV病毒多少的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖1可知，患者入院后，血清HBV的DNA滴度在18周為最高，以后逐步下降，在60周時(shí)最低，后又稍微升高。

圖1 患者血清HBV的DNA滴度Fig.1 HBV DNA counts

圖2 患者丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活性Fig.2 Alamine aminotransferase(ALT)concentrations

2.2 患者血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活性

患者血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活性是衡量慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸類(lèi)似物治療結(jié)果的重要生物化學(xué)指標(biāo)，由圖2可知，患者血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活性在18周為最高，以后逐步下降，22周后保持在較低水平。

2.3 患者血清HBV突變體

在該名慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸類(lèi)似物治療的過(guò)程中，篩選到了其血清中HBV突變體。由表1可知，在病人入院未治療即0周的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變體M204V和T213T;在拉米夫定治療期間，在18周和22周分別檢測(cè)到突變體LMV rtH69T(YMDDlocus)和LMV rtT184T(YMDDlocus)、LMV rtM204I(YMDDlocus)。在60周和70周分別檢測(cè)到ADV T213S、ADV T222A、ADV K212T和ADV S196L、ADV S242H，其中ADV S196L和ADV S242H 2種突變體是首次檢測(cè)到。

表1 不同治療階段血清樣品中突變體分析(數(shù)值為相應(yīng)克隆比值，%)Table 1 Evolution ofdrug resistant mutatios on clonal analysis of serial samples.Values are relative of clones(%)

3 討論

在利用核苷類(lèi)似物藥物拉米夫定和阿德福韋雙酯治療慢性乙型肝炎的過(guò)程中，隨著治療手段的進(jìn)步，HBV病毒迫于環(huán)境選擇壓力，也在不斷地突變和進(jìn)化，從而抑制了慢性乙型肝炎患者的治愈率，縮短了患者存活時(shí)間，臨床上至今無(wú)法解決這一難題。同時(shí)增加了慢性乙型肝炎患者的治療成本，延長(zhǎng)了治愈時(shí)間。

從本實(shí)驗(yàn)可以看出，患者在0周沒(méi)有開(kāi)始治療之前就已經(jīng)有了2個(gè)突變體M204V和T213T，說(shuō)明患者作為被感染者，HBV病毒抗核苷類(lèi)似物突變體就已經(jīng)在其他患者身上存在，可能是作為傳染源患者在接受核苷類(lèi)似物治療的時(shí)候，HBV病毒就已經(jīng)發(fā)生突變。在18、22和60周篩選出的患者HBV病毒突變體，其他研究者以前均發(fā)現(xiàn)過(guò)。而在70周篩選出的患者HBV病毒突變體ADV S196L和S242H，以前沒(méi)被發(fā)現(xiàn)過(guò)，說(shuō)明在生存環(huán)境變化的條件下，HBV病毒的突變是不定向的，這給治療慢性乙型肝炎新藥物研制帶來(lái)了極大的困難。

檢測(cè)HBV耐藥突變的方法，有基因芯片技術(shù)和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序等。拉米夫定和阿德福韋雙酯是目前被批準(zhǔn)并廣泛應(yīng)用于治療慢性乙型肝炎的核苷類(lèi)似物藥物，拉米夫定和阿德福韋致使HBV產(chǎn)生相關(guān)的耐藥位點(diǎn)。臨床研究表明，由于HBV聚合酶氨基酸序列發(fā)生了突變，使得藥物與HBV聚合酶的親和力下降，這是產(chǎn)生核苷(酸)類(lèi)似物耐藥的根本原因，進(jìn)而導(dǎo)致藥物抑制病毒復(fù)制的作用明顯減弱。盡管有許多內(nèi)外因素，如臨床用藥方式不當(dāng)、患者年齡、感染時(shí)間長(zhǎng)短、性別差異等影響慢性乙型肝炎的治療效果，但HBV產(chǎn)生耐藥突變體仍然是慢性乙型肝炎患者治療失敗的最重要因素?，F(xiàn)有抗病毒藥物還很少，因此慢性乙型肝炎的臨床治療還需要新藥的投入。

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