1株產(chǎn)酸堿指示劑的真菌的鑒定

張耀中，劉卉琳，蘭時樂，李琦，3，劉紹，4*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技學(xué)院，湖南長沙410128;3.湖南利爾康生物有限公司，湖南岳陽414100;4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128)

酸堿指示劑［1］是指在一定pH值范圍內(nèi)能顯示一定顏色的試劑。工作和實(shí)驗上常用的酸堿指示劑有酚酞、甲基橙、石蕊等［2-3］。實(shí)驗室常用的指示劑種類較少，有的變色也不靈敏，來源有限，且污染環(huán)境。近年來，越來越多的新指示劑被應(yīng)用到酸堿滴定中［4-5］。在自然界里，有許多微生物產(chǎn)生的色素在不同的酸堿性溶液中，都會發(fā)生顏色的變化，并且它們來源廣泛，廉價易得，天然環(huán)保［6］，因此從自然界發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生酸堿指示劑的微生物對保護(hù)自然環(huán)境和微生態(tài)系統(tǒng)具有重大意義。本實(shí)驗旨在對1株能夠產(chǎn)生酸堿指示劑的真菌進(jìn)行鑒定和研究，為后續(xù)研發(fā)微生態(tài)指示劑提供一定的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒菌株A-01和Escherichia coil DH5α均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗室提供，pGEM-T easy Vector購自Promega Bioteeh Co.，Ltd。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基;Gorodkowa培養(yǎng)基;LB培養(yǎng)基。

1.1.3 質(zhì)粒提取液溶液Ⅰ:葡萄糖50 mmol/L，Tris.Cl(pH 8.0)25 mmol/L，EDTA(pH 8.0)10 mmol/L，分裝后高壓滅菌15 min，4℃保存;溶液Ⅱ:NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%(質(zhì)量體積比);溶液Ⅲ:5 mol/L CH3COOK 60 mL，CH3COOH 11.5 mL，ddH2O 28.5 mL，pH 4.8;RNaseA:10 mg/mL溶于10 mmol/L Tris.Cl(pH 7.5)和15 mmol/L NaCl中，加熱15 min，－20℃保存;TE緩沖液(pH 8.0):Tris.Cl(pH 8.0)10 mmol/L，EDTA(pH 8.0)1.0mmol/L，滅菌。

1.2 方法

1.2.1 酸堿指示劑變色范圍的確定取待鑒定菌株接種進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，將菌株接種至馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)7 d。在無菌環(huán)境下，將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行過濾，取濾液。參照文獻(xiàn)［7］提供的方法研究濾液在不同pH值時的顏色變化。

1.2.2 形態(tài)學(xué)特征鑒定［8-9］①細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:取待鑒定菌株接種培養(yǎng)，無菌挑取菌株1環(huán)至PDA培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)7 d，鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)和無性繁殖方式;②培養(yǎng)特征:分別取待鑒定菌株接種培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至液態(tài)PDA培養(yǎng)基及PDA平板上，28℃下培養(yǎng)7 d。觀察液體培養(yǎng)液是否有浮膜、環(huán)及沉淀物;觀察固態(tài)培養(yǎng)基中菌落色澤、質(zhì)地、表面是否有褶皺及邊緣形狀;③子囊孢子的形成和形態(tài):取待鑒定菌株接種培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至馬鈴薯培養(yǎng)基和Gorodkowa培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)3～5 d，涂片觀察子囊孢子形態(tài)及孢子數(shù);④假菌絲的形成和形態(tài):取待鑒定菌株接種培養(yǎng)，用新鮮培養(yǎng)物劃線接種至PDA培養(yǎng)基上，在其上蓋上滅菌蓋片，28℃下培養(yǎng)7～9 d，在低倍鏡下觀察蓋片下劃線兩旁是否形成假菌絲。

1.2.3 DNA提取采用改良后的CTAB法［10-11］。將菌株接種于PDA斜面，25℃培養(yǎng)3 d。稱取2.0 g干菌絲，用液氮將其磨碎，加入提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，100 mmol/L EDTA，250 mmol/L NaCl)750 μL，混勻后加入20%SDS 50 μL，37℃放置1 h。然后，加入75 μL 5 mol/L NaCl，輕輕搖動離心管使其混合均勻，加入65 μL 10%CTAB+0.75 mol/L NaCl溶液混勻后放入65℃水浴20 min，加100 μL 3.5 mol/L NH4Ac，輕輕顛倒混勻，冰浴30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液，輕搖10 min，8 000 r/min離心5 min，抽提2次，取上層水相至另一離心管中，加入等體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻，4℃放置20 min，輕搖10 min，8 000 r/min離心5 min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀2次。干燥后用適量TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積預(yù)冷的5 mol/L LiCl，混勻，重復(fù)異丙醇洗滌及后續(xù)步驟。最后提取的DNA溶于30 μL TE緩沖液中。

1.2.4 PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1、ITS4擴(kuò)增rDNA ITS［12］，上、下游引物序列分別為ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×TaqE Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL，引物ITS1 1 μL，引物ITS4 1 μL，Taq DNA聚合酶(IU/μL)1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s;72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測:取5 μL產(chǎn)物加1 μL 6×上樣緩沖液，于含EB的1%瓊脂糖凝膠上100 V電泳40 min，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5 目的片段PCR產(chǎn)物回收與克隆采用O-mega公司小量膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的回收。所回收的目的片段與pGEMT-easy Vector 16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，涂布于含有抗生素Amp、4 μL IPTG(20%)和40 μL X-gal(2%)的LB平板上，37℃，培養(yǎng)16 h。用無菌牙簽挑取5個白色菌斑，分別放入2 mL LB培養(yǎng)液(添加Amp終濃度為100 mg/L)的10 mL玻璃離心管中，蓋好蓋子，于37℃250 r/min培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA后，在1.5 mL Eppendorf管中，分別加入16.5 μL的ddH2O，2 μL酶緩沖液，1 μL的質(zhì)粒DNA，0.5 μL的EcoRⅠ限制內(nèi)切酶。輕彈外壁以混勻，并短暫快速離心。將反應(yīng)混合物置于37℃水浴鍋中，反應(yīng)3 h左右，電泳觀察酶切結(jié)果。

1.2.6 序列測序及序列分析將質(zhì)粒DNA提交Invitrogen公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果輸入www.NCBI.nlm.nih.gov，利用BLAST軟件，將測得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿指示劑的變色范圍

試驗結(jié)果表明，待測濾液可做為酸堿指示劑，pH值小于6.5時呈紫紅色，pH值大于7.8時呈淡藍(lán)色，初步確定其變色范圍是pH值為6.5～7.8。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

形態(tài)學(xué)特征試驗證明該菌株在固體培養(yǎng)基上，其菌絲在培養(yǎng)初期呈白色，后期產(chǎn)紅色色素;子囊殼球形或卵形，單生或聚生;子囊孢子雙胞，無色，橢圓形，分隔處稍縊縮，無性態(tài)為串珠鐮孢(圖1、2)。

2.3 DNA的提取

提取菌株的DNA 經(jīng)紫外檢驗和1.0%的瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳鑒定，均符合實(shí)驗要求。

2.4 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，經(jīng)過PCR擴(kuò)增30個循環(huán)后通過1.0%的瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，成功擴(kuò)增出1條500 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶。

圖3 rDNA ITS區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR product of the rDNA ITS region gene

2.5 目的片段陽性克隆子的篩選與驗證

對擴(kuò)增出來的目的片段進(jìn)行回收。所回收的同源序列目的片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測之后與pGEM T-easy Vector連接。將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a，經(jīng)過抗生素Amp和α互補(bǔ)篩選后，產(chǎn)生了大量的白色菌落(圖4)。從LB抗性平板上隨機(jī)挑取5個白色單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

圖4 目的片段陽性克隆子的藍(lán)白篩選Fig.4 Fragment of blue-white screening positive clones

2.6 rDNA ITS的序列測定

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序(圖5)，結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對分析，rDNA的ITS區(qū)基因(包括5.8S rDNA)序列比對結(jié)果表明待測菌株與藤倉赤霉菌(Gibberella fujikuroi)完全一致，因此將待測菌株鑒定為藤倉赤霉菌。

圖5 擴(kuò)增rDNA ITS序列Fig.5 The sequence result of rDNA ITS genes

3 討論

經(jīng)過培養(yǎng)特征形態(tài)觀察及rDNA ITS的PCR擴(kuò)增獲得的ITS區(qū)基因(包括5.8S rDNA)序列與GenBank比對分析，確定了本研究所采用的A-01菌株為藤倉赤霉菌(Gibberella fujikuroi)。研究還表明該菌能產(chǎn)pH值變色范圍為6.5～7.8的酸堿指示劑。關(guān)于該酸堿指示劑具體性質(zhì)以及詳細(xì)結(jié)構(gòu)等有待進(jìn)一步研究。

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