胸水中肺腺癌細(xì)胞與血清中PTN多效蛋白分子生物學(xué)的研究

李長思，李明珠，楊利霞，王秀茹，杜明偉，李建華*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院暨附屬第一醫(yī)院病理科，遼寧沈陽110001;3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧沈陽110001)

PTN(pleiotrophin)最早是1989年在華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心純化的一種生長因子［1］，當(dāng)時認(rèn)為該因子為17 ku的蛋白，與肝素具有高親和性，并首次被命名為HBGF-8(heparin Binding growth factor-8)。1990年華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的進(jìn)一步研究［2］發(fā)現(xiàn)，該因子與當(dāng)時已知的7個與肝素結(jié)合的生長因子不存在明顯同源性，并因該蛋白具有多種生物學(xué)活性而改名為pleiotrophin(PTN)，意為多效蛋白，從而更能準(zhǔn)確地表達(dá)該因子的特性。PTN編碼168個氨基酸，與MK存在50%的序列同源性，兩者共同組成肝素結(jié)合超家族。PTN在多種腫瘤組織及血清中高表達(dá)［3-5］，具有促進(jìn)有絲分裂及血管新生的特性，影響腫瘤細(xì)胞的血供、生長及轉(zhuǎn)移。研究表明，PTN蛋白在肺癌組織中含量豐富，早期即可在血漿中出現(xiàn)，并且與腫瘤的分期相關(guān)［6］，2002年Jajer等用ELASA法檢測肺癌患者血清中的PTN表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PTN濃度比正常血清中的濃度顯著增高，并且與臨床病理分期成正相關(guān)，與化療藥物成負(fù)相關(guān)。本研究的目的是檢測PTN在肺腺癌不同標(biāo)本中的表達(dá)，并分析它們之間的關(guān)系，探討PTN在肺腺癌EMT轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料收集2008年至2010年間肺腺癌患者的術(shù)前血清83例和相對應(yīng)的肺腺癌所致的惡性胸水。另收取50例正常獻(xiàn)血者血清、50例良性胸水增生細(xì)胞(炎癥、結(jié)核、創(chuàng)傷所致)作為對照。所有標(biāo)本均取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科。

1.1.2 試劑鼠抗人PTN(H-6)(sc-74443)單克隆抗體(濃縮性)購自美國Snata公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗于4℃保存待用。兔抗人TTF1單克隆抗體(即用型)、鼠抗人CK19單克隆抗體(即用型)、鼠抗人E-ca單克隆抗體、兔抗人vimentin單克隆抗體(即用型)、S-P超敏免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)胸水標(biāo)本常規(guī)離心、沉淀包埋、切片、脫蠟、水化，按S-P法常規(guī)步驟進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞。著色強度:無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2分，2項得分相乘結(jié)果＞2記為陽性(+)，＜2為陰性。

1.2.2 Western-blot技術(shù)總蛋白從血清和胸水細(xì)胞中提取，冰上超生處理，4℃靜置，孵育50 min，4℃離心20 min(1 000 r/min)，提取上清，用Brodford法測定蛋白濃度，以每孔80 μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃，50 V條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，在分子量為18～25 ku附近剪開PVDF膜孵育一抗(PTN 1∶100稀釋)4℃過夜，X底片曝光，顯影，定影后拍照，以β-actin為內(nèi)參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BioImaging Systems，美國)分析蛋白各條帶的灰度值，并取其與β-actin的比值為相對表達(dá)量分析PTN的表達(dá)情況，每組結(jié)果均為相同體條件重復(fù)3次。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用χ2檢驗(不滿條件時用Fisher確切概率法)分析各組計數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中PTN蛋白Western-blot結(jié)果顯示

如圖1所示，在肺腺癌患者的血清中可見有特異性條帶，其中Ⅳ期肺腺癌患者的血清PTN蛋白表達(dá)水平明顯高于Ⅰ期肺腺癌患者的血清PTN蛋白表達(dá)水平。

2.2 PTN蛋白在胸水細(xì)胞中的免疫組化結(jié)果顯示

在本研究中，首先做了免疫細(xì)胞化學(xué)CK19、TTF1染色，在所收集的189例惡性胸水細(xì)胞中兩者均呈強陽性表達(dá)，由此推斷所收集的惡性胸水細(xì)胞標(biāo)本均為肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸水所致的惡性胸水細(xì)胞，如圖2所示。PTN蛋白在惡性胸水腺癌細(xì)胞的陽性率為59%(49/83)，在胸水良性增生細(xì)胞中的陽性率為0%(0/50)，PTN蛋白在惡性胸水細(xì)胞中的陽性率高于胸水良性增生細(xì)胞中的陽性率(P＜0.01)。

圖1 血清中PTN蛋白Western-blot結(jié)果顯示Fig.1 PTN protein Western-blot analysis showed in serum

圖2 PTN蛋白在胸水細(xì)胞中的免疫組化結(jié)果顯示(400×)Fig.2 PTN protein in pleural effusion cells in immunohistochemical results show(400×)

2.3 PTN蛋白的表達(dá)和EMT之間的關(guān)系

PTN蛋白在肺腺癌患者的2種不同標(biāo)本中陽性率的比較如表1所示，PTN蛋白在轉(zhuǎn)移至胸水細(xì)胞中的陽性率59%(49/83)高于血清中的陽性率32.5%(27/83)，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示PTN的表達(dá)在肺腺癌的EMT轉(zhuǎn)變中有非常重要的作用。83例肺腺癌轉(zhuǎn)移至胸水細(xì)胞中的PTN和Vimentin表達(dá)之間的關(guān)系如表2所示，PTN和Vimentin成正相關(guān)，差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，r=0.728)。

表1 PTN蛋白在2種不同標(biāo)本中陽性率的比較Table 1 The comparision of PTN protein positive rates in three difference specimens

表2 在惡性胸水腺癌細(xì)胞中PTN和Vimentin表達(dá)之間的關(guān)系Table 2 The relationship between PTN and Vimentin expressions in lung adenocarcinoma cells from pleural fluid

3 討論

肺癌對人類健康的危害日益嚴(yán)重，由于難以早期發(fā)現(xiàn)和易于轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肺癌死亡率增高，患者手術(shù)后5 a存活率降低。因此，近年來許多學(xué)者把研究的焦點聚集在肺癌的早期診斷和EMT(上皮間質(zhì)化)上。

癌癥的發(fā)生過程是一系列分子事件的作用引發(fā)的，包括基因突變(例如ras和p53基因突變)、生長因子和受體的過度表達(dá)、突變后的細(xì)胞能夠惡性增長和易發(fā)生轉(zhuǎn)移，并對藥物產(chǎn)生抵抗，激活的PTN可能通過某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使腫瘤細(xì)胞更惡性增長，因為發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中，PTN是高表達(dá)的，如神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、前列腺癌、wilms瘤、絨癌和黑色素瘤等［7］，在這些腫瘤組織中內(nèi)源性的PTN基因持續(xù)活化，而在相應(yīng)的正常組織中很難檢測到PTN的表達(dá)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中PTN和它的受體RPTPβ/ζ都表達(dá)增加［8］，并且它們的表達(dá)水平與該腫瘤惡性程度有關(guān)。PTN在某些腫瘤組織中，表現(xiàn)出細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗凋亡、血管生成和纖溶等與腫瘤侵襲性生長有關(guān)的特性［9］。

1998年Souttou等［10］用ELISA方法檢測消化道腫瘤患者血清中的PTN表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的PTN表達(dá)水平顯著高于正常對照，并與腫瘤的分期，腫瘤負(fù)荷相關(guān)。隨后用免疫組織化學(xué)方法檢測相應(yīng)腫瘤患者組織中的PTN表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中PTN高表達(dá)的腫瘤患者，其組織中PTN亦高表達(dá)，并且術(shù)后患者血清中的PTN濃度較術(shù)前大大降低。2002年Jajer等［11］也用ELISA方法檢測肺癌患者血清中的PTN表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中的PTN表達(dá)水平明顯高于對照組，并與腫瘤的分期成正相關(guān)，與化療藥的療效成負(fù)相關(guān)，推測檢測血清中的PTN表達(dá)水平可能成為早期診斷肺癌的一種有效方法。Jager等［12］在1997年應(yīng)用RT-PCR檢測了26株肺癌細(xì)胞系中的PTN mRNA表達(dá)，其中有12株小細(xì)胞肺癌(SCLC)，14株非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，結(jié)果顯示9株SCLC和3株NSCLC有PTN mRNA的表達(dá)。

細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化(EMT)時，EMT表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性，與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，細(xì)胞黏附力下降，遷移和運動能力增加，同時細(xì)胞表型發(fā)生改變，而在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞首先獲得EMT的特性，以實現(xiàn)對周圍組織的浸潤和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，一旦這一過程完成，這些細(xì)胞就可能通過間質(zhì)細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)型(mesenchyma-ep ithelial transition，MET)而重新獲得增殖能力［13-14］，Mitsiadis等［15］在1995年研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育(胚胎形成的9～14.5 d)和器官形成過程中，PTN在上皮間質(zhì)化過程中發(fā)揮作用，如在神經(jīng)系統(tǒng)、感覺器官、呼吸器官、消化器官、泌尿生殖器官以及骨骼和牙齒的發(fā)育過程中這2種蛋白都可以被檢測出來。那么PTN在腫瘤EMT形成過程中是否也發(fā)揮重要的作用呢，2006年P(guān)erez-Pinera等［16］研究發(fā)現(xiàn)PTN可以破壞鈣依賴的細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附從而引起EMT，但這是作者在體外PTN處理細(xì)胞獲得的結(jié)論，然而在體內(nèi)肺腺癌細(xì)胞中是否有PTN蛋白的存在，以及在肺腺癌EMT轉(zhuǎn)變過程中其作用是什么。

本研究發(fā)現(xiàn)PTN在肺腺癌患者的2種不同標(biāo)本中均高表達(dá)，同時直接比較早期肺腺癌(未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺腺癌血清)和中晚期肺腺癌(發(fā)生轉(zhuǎn)移的胸水)中PTN蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在中晚期肺腺癌中較早期肺腺癌中PTN蛋白的表達(dá)率高，說明PTN蛋白的表達(dá)在肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。

以上研究表明PTN在肺腺癌中高表達(dá)，并且在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中也起重要的作用，尤其在肺腺癌的EMT轉(zhuǎn)變中，其作用越來越受到人們的重視。未來的研究可以PTN作為藥物靶點，或者對其信號通路進(jìn)行干預(yù)，或者體外合成PTN抑制劑，達(dá)到下調(diào)PTN的作用［17］，從而阻止EMT過程的發(fā)生。

［1］ Milner PG，Li YS，Hoffman RM，et al.A novel 17 ku beparinbinding growth factor(HBGF-8)in bovine ulerus:purification and N-terminal amino acid sequence［J］.Biochem Biophys Res Commun，1989，165(3):1096-1103.

［2］ Li YS，Hoffman RM，Le Beau MM，et al.Characterization of the human pleiotrophin gene.Promoter region and chromosomal localization［J］.J Biol Chem，1992，267(36):26011-26016.

［3］ Liliental J，Moon SY，Lesche R，et al.Genetic deletion of the pten tumor suppressor gene promotes cell motility by activation of Rac1 and Cdc42 GTPases［J］.Curr Biol，2000，10(7):401-404.

［4］ Kilpelkinen I，Kaksonen M，Kinnunen T，et al.Heparin-binding growth-associated molecule contains two heparin-bindingβ-sheet domains that are homologous to the thrombospondin typeⅠrepeat［J］.J Biol Chem，2000，275(18):13564-13570.

［5］ Polykratis A，Delbe J，Courty J，et al.Identification of heparin affin regulatory peptide domains with potential role on angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(10):1954-1966.

［6］ 謝海燕，姜藻.多效蛋白在惡性胸腔積液中的診斷價值［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，6(47):29-31.

［7］ Matsuura O，Kadomatsu K，Takei Y，et al.Midkine expression is associated with postnatal development of the lungs［J］.Cell struct funct，2002，27(2):109-115.

［8］ Polykratis A，Delbe J，Courty J，et al.Identification of heparin affin Regulatory peptide domains with potential role on angiogenesis［J］.Int JBiochem Cell Biol，2004，36(10):1954-1966.

［9］ Deuel TF，Zhang N，Yeh HJ，et al.Pleiotrophin:a cytokine with diverse functions and a novel signaling pathway［J］.Arch Biochem Biophys，2002，397(2):162-171.

［10］ Souttou B，Juhl H，Hackenbruck J，et al.Relationship between serum concentrations of the growthfactorpleiotrophin and pleiotrophin-positive Tumors［J］.Natl cancer Inst，1998，90(19):1468-1473.

［11］ Jajer，list，et al.Serum levels of the angiogenic factor pleiotrophin in relation todisease stage in lung cancer patients［J］.Cancer Research UK，2002，86(6):858-863.

［12］ Jager R，Noll K，Havemann K，et al.Differental expression and biologicalactivity of the heparin-binding growth-associated molecule(HB-GAM)in Lung cancer［J］.Int Cancer，1997，73(4):537-543.

［13］ 楊文君，陳麗榮.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用［J］.實用腫瘤雜志，2008，23(1):86-90.

［14］ 徐江鋒，羅庚求.上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型與腫瘤轉(zhuǎn)移［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27(5):393-396.

［15］ Mitsiadist TA，Salmivirtam M，Muramatsut T，et al.Expression of the heparin-binding cytokines，midkine(MK)and HBGAM(pleiotrophin)is associated with epithelial-mesenchymal interactions during fetal development and organogenesis［J］.Development，1995，121(1):37-51.

［16］ Perez-Pinera P，Alcantara S，Dimitrov T，et al.Pleiotrophin disrupts dependent-homophilic cell-cell adhesion and initiates an mesenchymal-transition［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:17795-17780.

［17］ 張宏艷，李剛，宋三泰.pleiotrophin研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2005，2(28):65-68.