采用熔點曲線法研究乙肝病毒準(zhǔn)種與拉米夫定臨床耐藥相關(guān)性

溫志立，王艷華，張華，張海明，譚德明，李慶安，吳平，鄧樂

(1.南昌市第九醫(yī)院，江西南昌330008;2.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科，江西南昌330008;3.南昌市衛(wèi)生學(xué)校，江西南昌330008;4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染科，湖南長沙410008;5.中國人民解放軍第163醫(yī)院感染科，湖南長沙410008)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球約20億人曾感染過乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌［1］。近年來，由于拉米夫定等核苷類抗病毒藥物的不斷應(yīng)用，一度給慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的治療帶來曙光，但是由于在抗病毒治療過程中不斷出現(xiàn)的病毒耐藥、停藥后反彈等問題，給臨床醫(yī)師及患者帶來許多困惑。2005年《慢性乙型肝炎防治指南》提出了HBV準(zhǔn)種的概念，即將HBV感染者體內(nèi)形成以一個優(yōu)勢株為主的相關(guān)突變株病毒群稱為HBV準(zhǔn)種［2］。國內(nèi)外已有研究表明，HBV感染的慢性化、疾病轉(zhuǎn)歸及藥物治療耐受等都可能與HBV準(zhǔn)種密切相關(guān)［3］，例如拉米夫定等核苷類似物耐藥的產(chǎn)生就與HBV P基因準(zhǔn)種的變異有關(guān)，而且HBV P基因變異是多位點的，以YMDD基因的變異最為重要。因此，通過監(jiān)測HBV P基因準(zhǔn)種的變化有助于預(yù)測HBV對拉米夫定等核苷類似物的耐藥。熔點曲線是通過動態(tài)檢測雙鏈DNA分子的熔點溫度(Tm)進行單核苷多態(tài)性分析的一種分子生物學(xué)方法。當(dāng)同一樣本中存在不同的基因變異(或稱準(zhǔn)種)時，由于G/C含量變化導(dǎo)致Tm值可能改變，便可出現(xiàn)與準(zhǔn)種數(shù)量相對應(yīng)的幾個波峰，該法操作簡便，用于病毒準(zhǔn)種檢測準(zhǔn)確可靠，之前已用熔點曲線分析了HBV準(zhǔn)種和臨床病情的相關(guān)性［4］，取得了較好結(jié)果。為此，準(zhǔn)備在之前基礎(chǔ)上，采用熔點曲線技術(shù)從準(zhǔn)種的角度來探索HBV對拉米夫定耐藥機制，從而為臨床抗病毒治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象采用查隨機數(shù)字表方法，從2008年3月至2009年11月期間在南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院感染科住院及門診就診的CHB患者中，隨機選擇30例接受拉米夫定抗病毒治療后發(fā)生YMDD病毒變異的患者和30例停用拉米夫定后發(fā)生病毒學(xué)反彈的患者作為研究對象，同時隨機選擇30例沒有接受拉米夫定抗病毒治療的患者作為對照。在這90例病人中有男性73例，女性17例，年齡22～65歲，平均年齡(38.1±12.5)歲。為避免患者病情輕重不一給實驗帶來的干擾，所有病例均為CHB中度病例，均按照2010年全國肝炎會議最新修訂的《慢性乙肝防治指南》［5］標(biāo)準(zhǔn)選擇，而且血清HBsAg陽性至少6個月，剔除重疊HIV、HCV或HDV感染、自身抗體陽性、失代償期肝病、甲亢患者、精神病患者及妊娠婦女，近6個月無抗病治療史，甲狀腺功能正常。病毒變異組和病毒反彈組患者均口服拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司)抗病毒治療，每次100 mg，每日1次，療程均在1 a以上。所有患者均理解研究內(nèi)容并簽署知情同意書。收集所有90例患者的血清標(biāo)本，保存于－70℃。

1.1.2 主要試劑DNA抽提試劑盒由上海達安基因公司提供;dNTPs(10 mmol/L，北京全式金公司);Taq DNA Polymerase(5 U/μL，美國NBI公司產(chǎn)品);Mg2+(10 mmol/L，美國NBI公司產(chǎn)品);10×Buffer緩沖液購自Fermantas公司;2%SYBR Green I熒光染料(美國Molecular proble公司提供);1 mmol/L的純熒光素校準(zhǔn)染料(Fluorescein Calibration Dye，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品);用純熒光素校準(zhǔn)染料稀釋緩沖液將其稀釋1 000倍，配成1 μmol/L的稀釋液。

1.1.3 引物參照溫志立等［4，6］文獻設(shè)計引物，其中引物P1、P2擴增P基因長片段(1 058 bp)，引物C1、C2擴增C基因長片段(639 bp)，引物S1、S2擴增S基因長片段(1 178 bp)，均由上海生物工程科技公司合成(表1)。

表1 擴增HBV P基因、C基因和S基因的引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying HBV P gene，C gene and S gene

1.1.4 主要儀器實時熒光PCR儀器(7300，美國ABI公司);金屬干浴器(K30，深圳威斯比生物科技發(fā)展公司);低速臺式離心機(TD5A-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司);超凈化工作臺(SW-CJ-IF型，蘇州凈化設(shè)備廠);－20℃冰箱(日本三洋公司);－70℃超低溫冰箱(MDF-u208bs，日本三洋公司)。

1.2 方法

1.2.1 HBV-DNA提取取1.5 mL PCR管加入50 μL DNA提取液，再加入待測血清50 μL，震蕩后混勻，置入金屬干浴器，100℃10 min后取出，放置，待冷卻至室溫后置入離心機中，12 000 r/min離心10 min，取上清2 μL做為PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 熒光實時PCR及熔點曲線分析參照文獻［7］進行。取0.2 mL PCR管，按下列體系加入:P1/C1/S1(50 pmol/L)0.5 μL，P2/C2/S2(50 pmol/L)0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Pulas Taq 0.5 U，Mg2+(25 mmol/L)2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板0.5 μL，2%SYBR Green I 0.5 μL，自制熒光染料緩沖液0.5 μL，加DDW定容至25 μL。置入ABI7300實時熒光PCR儀中，按下列條件進行擴增:95℃預(yù)變性5 min，94℃60 s，58℃60 s，72℃60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。擴增結(jié)束后按ABI7300PCR反應(yīng)儀設(shè)定的條件進行熔點曲線分析，55℃開始收集熒光信號，直到95℃后結(jié)束。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理，數(shù)據(jù)用ˉχ±S表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

拉米夫定治療后病毒變異組患者體內(nèi)HBV P區(qū)準(zhǔn)種數(shù)量為2.50±0.86個，病毒反彈組為5.30±0.95個，未治療組為8.37±0.93個。3組準(zhǔn)種數(shù)量兩兩比較，P均小于0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。HBV C區(qū)病毒變異組準(zhǔn)種數(shù)量為6.10±1.86個，病毒反彈組為6.37±1.81個，未治療組為6.33±1.64個。3組準(zhǔn)種數(shù)量兩兩比較，P均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。HBV S區(qū)病毒變異組準(zhǔn)種數(shù)量為5.23±1.85個，病毒反彈組為6.17±1.93個，未治療組為5.77±2.11個。3組準(zhǔn)種數(shù)量兩兩比較，P均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 不同組別熔點曲線波峰數(shù)量比較(±S)Table 2 comparison of wave peak amounts among different groups

表2 不同組別熔點曲線波峰數(shù)量比較(±S)Table 2 comparison of wave peak amounts among different groups

組別例數(shù)P區(qū)C區(qū)S區(qū)302.50±0.866.10±1.865.23±1.85病毒反彈組305.30±0.956.37±1.816.17±1.93未治療組308.37±0.936.33±1.645.77±2.11 P P＜0.05P＞0.05P＞0.05病毒變異組

從3組患者的HBV P區(qū)熔點曲線圖(圖1～3)中還可以清晰地看到，病毒變異組優(yōu)勢病毒群的熔點與病毒反彈組和未治療組相比，已發(fā)生明顯的偏移，病毒反彈組和未治療組優(yōu)勢病毒群的熔點均在75～80℃之間，而病毒變異組優(yōu)勢病毒群的熔點卻在75℃以下。在3組患者的HBV C區(qū)和S區(qū)熔點曲線圖中，3組的波峰數(shù)和優(yōu)勢病毒群的熔點均沒有明顯變化。

圖1 病毒變異組HBV P區(qū)熔點曲線圖Fig.1 Melt curve plot of HBV P gene in virus variation group

圖2 病毒反彈組HBV P區(qū)熔點曲線圖Fig.2 Melt curve plot of HBV P gene in virus rebound group

圖3 未治療組HBV P區(qū)熔點曲線圖Fig.3 Melt curve plot of HBV P gene in non-treatment group

3 討論

準(zhǔn)種現(xiàn)象普遍存在于RNA病毒中，HBV雖屬DNA病毒科，但同樣存在準(zhǔn)種現(xiàn)象，而且準(zhǔn)種是乙型肝炎病毒存在的基本方式，其各編碼區(qū)均存在準(zhǔn)種。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HBV準(zhǔn)種與核苷類似物的耐藥密切相關(guān)。2000年Richman［8］認(rèn)為，HBV對某一抗病毒藥物表現(xiàn)耐受其實是一個逐漸發(fā)展的過程。在未接受過核苷類藥物治療的患者中，HBV野生株占HBV準(zhǔn)種的絕大多數(shù)，但耐藥變異株在患者用藥前就可能存在，也有可能在用藥過程中產(chǎn)生。患者用藥后，對藥物敏感的病毒野生株受到抑制，含有耐藥突變的準(zhǔn)株得以有更多空間進行復(fù)制。當(dāng)對某一藥物有耐藥性的病毒株成為準(zhǔn)種中的優(yōu)勢病毒株時，藥物就失去療效。耐藥株的復(fù)制能力和適應(yīng)能力雖然較野生株弱，但在藥物選擇壓力持續(xù)存在的情況下，產(chǎn)生許多代償性突變株，使其復(fù)制能力增強，輔助耐藥株成為準(zhǔn)種的優(yōu)勢株［9］。由此可知HBV耐藥株的產(chǎn)生過程其實就是耐藥株從逆勢種群向優(yōu)勢種群變遷的過程。

乙肝病毒準(zhǔn)種可采用不同的方法來進行鑒定和分析，如聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶切片段長度多態(tài)性分析(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)法［10］、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)法［11］等。PCR-RFLP法對于限制性酶切點發(fā)生突變的檢測十分有效，但對某些靶序列并不適合。SSCP是目前準(zhǔn)種分析的主要手段之一，具有快速、簡便、靈敏等特點，其原理基于點突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變，通過電泳分離可鑒別，它可以檢測各種點突變、短核苷酸序列的缺失或插入，但其工作量大，操作步驟煩瑣，電泳條件要求較嚴(yán)格，而且當(dāng)某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時，電泳就無法分辨。同SSCP相比，熔點曲線法是一種比較簡便、實用的檢測準(zhǔn)種的方法，是通過動態(tài)檢測雙鏈DNA分子的熔點溫度(Tm)進行單核苷多態(tài)性分析的一種分子生物學(xué)方法，其主要原理在于SYBR Green I是不對稱腈類熒光素，一般不與單鏈DNA結(jié)合，但能非特異嵌合于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝內(nèi)，結(jié)合狀態(tài)的熒光強度較之游離狀態(tài)的熒光增加數(shù)千［7］。因此，只需要在擴增體系中直接加入SYBR Green I即可實時PCR定量及基因變異分析。當(dāng)同一樣本中存在不同的基因變異(或準(zhǔn)種)時，由于G/C含量變化導(dǎo)致Tm值改變，便可出現(xiàn)與準(zhǔn)種數(shù)量相對應(yīng)的幾個波峰。國外學(xué)者已經(jīng)研究證實，溶點曲線方法操作簡便，準(zhǔn)確可靠，很好解決了其他準(zhǔn)種鑒定方法所遇到的問題［12］。

本實驗采用熔點曲線法分析了3種CHB患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種情況，包括HBV基因突變導(dǎo)致耐藥患者、停藥后發(fā)生病毒反彈患者和未經(jīng)拉米夫定治療患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組HBV P區(qū)準(zhǔn)種數(shù)量有顯著性差異(P＜0.05)，從小到大依次為病毒變異組、病毒反彈組和未治療組，而且病毒變異組優(yōu)勢病毒群的熔點與病毒反彈組、未治療組相比，已發(fā)生明顯的偏移，這說明在拉米夫定壓力下，HBV發(fā)生變異，不僅P區(qū)的準(zhǔn)種數(shù)量明顯減少，而且準(zhǔn)種的性質(zhì)也發(fā)生了明顯的變化，這可能是由于一些耐藥的劣勢準(zhǔn)種隨著優(yōu)勢準(zhǔn)種逐漸被殺滅，趁勢大量繁殖而成為優(yōu)勢準(zhǔn)種所致。黃燕萍等［11］應(yīng)用SSCP/異源雙鏈分析法研究了拉米夫定與HBV準(zhǔn)種及變異特點的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)拉米夫定治療前HBV P區(qū)準(zhǔn)種數(shù)量為7～14(平均9.8)，高于治療后準(zhǔn)種數(shù)量4～8(平均5.7)，并認(rèn)為在拉米夫定藥物篩選下HBV準(zhǔn)種改變，同時出現(xiàn)YMDD序列變異，與本研究結(jié)果相似。Ohishi［13］用PCR-肽核酸鉗法檢測了CHB患者使用拉米夫定治療前后的HBV準(zhǔn)株，發(fā)現(xiàn)治療前患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)株數(shù)高于治療后，但治療后的優(yōu)勢準(zhǔn)株數(shù)卻高于治療前。在長期使用拉米夫定過程中，當(dāng)耐藥突變株成為準(zhǔn)種的優(yōu)勢株時，不僅可引起耐藥，同時還可增加不良事件的發(fā)生概率。Lok［14］通過回顧性分析一項拉米夫定耐藥安全性3期臨床實驗的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，相比于沒有拉米夫定耐藥的患者，耐藥者有更高的肝炎復(fù)發(fā)比率。另外，經(jīng)過對S區(qū)、C區(qū)準(zhǔn)種進行分析，結(jié)果顯示3組病人的HBV C區(qū)和S區(qū)準(zhǔn)種數(shù)量均無顯著性差異(P＞0.05)，優(yōu)勢準(zhǔn)種的熔點也無明顯變化，這說明拉米夫定對HBV S區(qū)、C區(qū)基本上沒有作用，與國內(nèi)外關(guān)于拉米夫定耐藥位點的報道相符。

［1］ Rybicka M，Stalke P，Charmuszko U，et al.The influence of hepatitis B virus polymorphism on the progression of chronic liver disease［J］.Postepy Hig Med Dosw(online)，2011，21(65):244-254.

［2］ 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(12):881-891.

［3］ 陳恩強，雷秉鈞，唐紅.乙型肝炎病毒準(zhǔn)種的臨床應(yīng)用及其研究進展［J］.世界華人消化雜志，2008，16(10):1086-1091.

［4］ 溫志立，譚德明，彭仕芳，等.熔點曲線法研究乙型肝炎病毒準(zhǔn)種和臨床表現(xiàn)的關(guān)系［J］.中華肝臟病雜志，2006，14(1):19-22.

［5］ 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2011，6(1):67-77.

［6］ 溫志立，譚德明.多對型特異性引物巢式PCR檢測湖南省乙肝病毒基因型［J］.世界華人消化雜志，2004，12(2):332-335.

［7］ Wang CY，Giambrone JJ，Smith BF.Detection of duck hepatitis B virus DNA on filter paper by PCR and SYBR green dyebased quantitative PCR［J］.J Clin Microbiol，2002，40(7):2584-2590.

［8］ Richman DD.The impact of drug resistance on the effectiveness of chemotherapy for chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2000，32(4):866-867.

［9］ Locarnini S.慢性乙型肝炎抗病毒耐藥及其處理［J］.肝臟，2007，12(3):161-163.

［10］ 劉妍，董箐，皇甫競坤，等.乙型肝炎病毒核心啟動子區(qū)基因異質(zhì)性及對其轉(zhuǎn)錄活性的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2002，27(2):128-130.

［11］ 黃燕萍，王宇明，蘭林，等.拉米夫定與乙型肝炎病毒準(zhǔn)種及變異特點的關(guān)系［J］.中華肝臟病雜志，2003，11(4):235-238.

［12］ Hewson KA，Browning GF，Devlin JM，et al.Application of high-resolution melt curve analysis for classification of infectious bronchitis viruses in field specimens［J］.Aust Vet J，2010，88(10):408-413.

［13］ Ohishi W，Shirakawa H，Kawakami Y，et al.Identification of rare polymerase variants of hepatitis B virus using a two-stage PCR with peptide nucleic acid clamping［J］.J Med Virol，2004，72(4):558-565.

［14］ Lok AS，Lai CL，Leung N，et al.Long-term safety of lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B［J］.Gastroenterology，2003，125(6):1714-1722.