內(nèi)生放線菌對(duì)鬼臼毒素的微生物轉(zhuǎn)化

曹松，曾志剛

(中國醫(yī)藥集團(tuán)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都610052)

鬼臼毒素(Podophyllotoxin)(圖1)又名鬼臼素、鬼臼毒，是一種具抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，屬于木脂素類，主要從鬼臼類植物(桃兒七、八角蓮、山荷葉)中分離得到［1-2］。鬼臼毒素通過破壞有絲分裂細(xì)胞中的微管蛋白集結(jié)及微管的形成，使細(xì)胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細(xì)胞分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用［3-4］。瑞士Sandoz公司首先合成了鬼臼毒素的C-4位糖苷化衍生物依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)，用于治療肺癌、淋巴癌、白血病、睪丸癌等［5-6］。但鬼臼毒素具有強(qiáng)烈的毒副作用，如:導(dǎo)致貧血、脫發(fā)、胃腸道功能紊亂、骨髓抑制等，限制了其臨床使用［7］，因此其分子結(jié)構(gòu)有進(jìn)一步修飾的必要。

圖1 鬼臼毒素Fig.1 Podophyllotoxin

為獲得結(jié)構(gòu)新穎的鬼臼毒素類活性物質(zhì)，探索它們的構(gòu)效關(guān)系，一條途徑是用化學(xué)合成方法改造其結(jié)構(gòu)，另一條途徑是微生物轉(zhuǎn)化。微生物轉(zhuǎn)化具有區(qū)域和立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，還能完成一些化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)，常被用于天然產(chǎn)物的化學(xué)修飾，以獲得一些結(jié)構(gòu)更合理或活性更好的類似物或衍生物［8-12］。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)鬼臼毒素的微生物轉(zhuǎn)化作了一些探索，北京大學(xué)果德安教授［13-14］利用青霉菌和掌葉大黃細(xì)胞轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D環(huán)的反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為順式，得到無活性的鬼臼苦素。英國諾丁漢大學(xué)Broomhead等［15］發(fā)現(xiàn)美國金鐘連翹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有將鬼臼毒素氧化為鬼臼毒酮的能力。澳大利亞墨爾本大學(xué)Teng等［16］利用大麥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，得到異鬼臼苦酮。本研究從桃兒七根莖中分離出能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素的內(nèi)生放線菌，用其轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，獲得了1種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析初步確定為4'-去甲基表鬼臼毒素，菌種鑒定為Streptomyces sp.，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)生菌與鬼臼毒素的微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)理和開發(fā)利用鬼臼毒素類活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集2010年4月中旬，于成都植物園采集桃兒七根莖樣品，樣品經(jīng)1 d左右自然風(fēng)干后進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基(ISP2):酵母粉4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.3，121℃滅菌20 min;種子培養(yǎng)基/轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，玉米漿5 g，牛肉膏3 g，F(xiàn)eCl30.05 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑鬼臼毒素購自西安楊森制藥有限公司，純度98%;PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司;PCR回收試劑盒、合成引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;序列測(cè)定于英俊生物科技有限公司。

1.1.4 儀器島津LC-20A高效液相色譜儀;Varian Mercury-300BB型核磁共振儀;Agilent MSD Trap離子阱質(zhì)譜儀。

1.2 方法

1.2.1 桃兒七根莖內(nèi)生放線菌的分離材料預(yù)處理采用75%乙醇擦拭表面及切口，并于火焰上快速烤干，風(fēng)干保存1 d左右后處理進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，如近期不分離的材料則置于4℃保存。表面消毒采用Coombs等［17］方法，使用無菌刀將消毒后的莖部組織切成1 cm2左右的小片，貼在分離培養(yǎng)基表面，留下最后一遍無菌水清洗液做涂布對(duì)照，用來檢測(cè)表面消毒效果。接種后于28℃培養(yǎng)間培養(yǎng)3～5周。約3～4周后，大多數(shù)內(nèi)生放線菌長(zhǎng)出，無菌操作條件下用接種針挑取放線菌到ISP2平板劃線，純化后的菌株轉(zhuǎn)接到ISP2斜面活化培養(yǎng)。

1.2.2 鬼臼毒素轉(zhuǎn)化菌株的篩選將分離的內(nèi)生放線菌接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶(250 mL)中，28℃振蕩培養(yǎng)3 d，然后以10%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，發(fā)酵3 d，然后在搖瓶中加入用乙醇溶解的鬼臼毒素30 mg，繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔1 d取10 mL包含菌絲體的發(fā)酵液，用勻漿器搗碎，利用等量的乙酸乙酯萃取，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮萃取液，用TLC和高效液相色譜(HPLC)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，篩選能對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的內(nèi)生菌株。TLC條件:展開劑為氯仿-丙酮(5∶1)，254 nm紫外顯色;HPLC條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

1.2.3 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定按上述方法對(duì)篩選獲得的內(nèi)生放線菌發(fā)酵，收集10 L發(fā)酵液，離心分離菌絲體并用勻漿器搗碎，而后與上清液合并，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮部分(5.2 g)經(jīng)過硅膠柱層析(流動(dòng)相氯仿-丙酮梯度洗脫)分離，獲得相關(guān)組分A(50 mg)，然后用制備HPLC(流動(dòng)相乙腈∶水=50∶50)純化，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A(15 mg)，然后對(duì)其做質(zhì)譜和核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.4 內(nèi)生放線菌的鑒定①菌絲形態(tài)觀察:通過掃描電鏡觀察菌絲的形態(tài)，在ISP2平板上挖1 cm寬的長(zhǎng)方形小穴，在穴的邊緣接種，然后蓋上無菌蓋玻片，培養(yǎng)10～14 d，取出蓋玻片噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察;②菌落培養(yǎng)特征:選取9種培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)菌株，觀察并記錄第4、7和14天菌落形態(tài)以及色素的有無和顏色等。9種培養(yǎng)基包括ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蔗糖察氏培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基;③生理生化特性:實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行，對(duì)菌株的生長(zhǎng)條件(溫度、pH)、NaCl耐受性、C源利用、N源利用、酯酶分解、淀粉水解、明膠液化、牛奶凝固及凍化、纖維素分解、硝酸鹽還原、MR實(shí)驗(yàn)、色氨酸分解、H2S產(chǎn)生、氧化酶和過氧化氫酶產(chǎn)生等生理生化指標(biāo)進(jìn)行了考察;④16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序:采用酶解法提取菌絲體的DNA，選用通用引物PA8:5'-CCGTCGACGAGCT CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，PB1:5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，擴(kuò)增16S rRNA基因序列。利用上海生工生物工程公司SanPrep DNA膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后送樣、測(cè)序;⑤系統(tǒng)發(fā)育分析:將菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上BLAST比對(duì)，再用Eztaxon數(shù)據(jù)庫對(duì)序列進(jìn)行在線分析［19］，把相近模式菌種的序列放在一起做比對(duì)，序列比對(duì)采用Bioedit和Clustal X軟件，然后用Mega 4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹［20］。并將測(cè)得序列提交GenBank注冊(cè)，獲得登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離及轉(zhuǎn)化鬼臼毒素菌株的篩選

圖2 鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of podophyllotoxin standards

圖3 CS-1轉(zhuǎn)化鬼臼毒素HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of podophyllotoxin biotransformed by CS-1

利用純培養(yǎng)法從桃兒七根莖分離獲得20株內(nèi)生放線菌，編號(hào)為CS-1～CS-20。將20株內(nèi)生放線菌接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入鬼臼毒素繼續(xù)培養(yǎng)，然后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行TCL和HPLC分析，篩選能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素的內(nèi)生放線菌。經(jīng)過幾輪篩選發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生放線菌CS-1能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素生成產(chǎn)物1。圖2是鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，圖3是CS-1菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜，其中峰1是新出現(xiàn)的峰，為鬼臼毒素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的吸收峰，峰2是鬼臼毒素的吸收峰，峰3是培養(yǎng)基的吸收峰。HPLC檢測(cè)條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2.2 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1的結(jié)構(gòu)鑒定

生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1(15 mg)為白色粉末。ESIMS中m/z 399處出現(xiàn)［M-H］－的分子離子峰，表明產(chǎn)物1的相對(duì)分子質(zhì)量為400，比底物鬼臼毒素小了14，恰好為1個(gè)亞甲基。其1H NMR(DMSO)數(shù)據(jù)與4'-去甲基表鬼臼毒素的文獻(xiàn)值一致(表1)［21］，可以推斷它是4'-去甲基表鬼臼毒。

表1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物11H NMR(DMSO)的化學(xué)位移(×10－6)Table 1 1H NMR data of transformation product 1(δ values in×10－6)

2.3 鬼臼毒素轉(zhuǎn)化內(nèi)生放線菌鑒定

2.3.1 形態(tài)特征菌株CS-1在ISP2培養(yǎng)基中產(chǎn)生基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，菌絲無橫隔，不斷裂(圖4)。菌落表面呈皺褶狀，顏色呈灰白色;基內(nèi)菌絲呈黃褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。

圖4 CS-1在ISP2培養(yǎng)基上11 d的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM photograph of strain CS-1 on ISP2 medium for 11days

2.3.2 培養(yǎng)特征菌株CS-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不長(zhǎng)，在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較差，ISP3、LB、TSB、ISP4等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)中等，在其他培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在這9種培養(yǎng)基中都不產(chǎn)生可溶性色素，菌落形態(tài)、基內(nèi)菌絲顏色變化較大，見表2。

表2 CS-1在不同培養(yǎng)基上的特征Table 2 Characteristics of CS-1 on different medium

2.3.3 生理生化特征菌株CS-1在20～40℃、pH 6～12條件下可以生長(zhǎng)，能耐受10%NaCl，該菌能利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇、鼠李糖、甘油、膠醛糖、α-半乳糖、D-木糖，不能利用山梨醇、葡糖糖、山梨糖作為碳源;能較好地利用L-纈氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸，微利用L-組氨酸，不利用L-色氨酸、L-賴氨酸、尿素、甘氨酸。菌株CS-1不能水解淀粉，可使明膠液化，牛奶凝固且凍化，能水解Tween 80、不能分解纖維素;不能使甲基紅變紅，不產(chǎn)生硫化氫，無法還原硝酸鹽，能產(chǎn)生色氨酸酶、氧化酶以及過氧化氫酶。生理生化特征見表3。2.3.416S rRNA的序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育N-J樹以菌株總DNA為模板，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，回收、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(1 434 bp 16S rRNA基因)提交至NCBIGenBank，獲得登錄號(hào):JQ065718。將菌株16S rRNA基因序列與相近模式菌比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，菌株與Streptomyces violaceorubidus LMG 20319T(AJ781374)最為接近，相似度為99.856%;兩者在進(jìn)化樹上呈單獨(dú)1枝，為鏈霉菌的疑似種，確定為Streptomyce sp.。系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖5。

表3 菌株CS-1的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characters of strain CS-1

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain CS-1 and related Streptomyces species

3 討論

用內(nèi)生放線菌CS-1對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)它能將鬼臼毒素轉(zhuǎn)化為4'-去甲基表鬼臼毒素，表明內(nèi)生放線菌CS-1可能具有O-去甲基化酶，能在鬼臼毒素的甲氧酚上發(fā)生去甲基化反應(yīng)，還可能具有異構(gòu)化酶將C4位α構(gòu)型轉(zhuǎn)化為β構(gòu)型。并且這2種酶是同時(shí)或共同轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)4'-去甲基鬼臼毒素或表鬼臼毒素這樣的中間體。由此可以推測(cè)，內(nèi)生放線菌CS-1對(duì)鬼臼毒素的轉(zhuǎn)化路徑可能是由鬼臼毒素直接轉(zhuǎn)化為4'-去甲基表鬼臼毒素(圖6)。Hande［22］研究發(fā)現(xiàn)4'-去甲基表鬼臼毒素抗腫瘤活性增強(qiáng)，其抗腫瘤機(jī)制發(fā)生改變，鬼臼毒素是通過破壞正在進(jìn)行有絲分裂細(xì)胞中的微管蛋白集結(jié)及微管的形成，使細(xì)胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細(xì)胞正常分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用，而4'-去甲基表鬼臼毒素是通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，可以通過進(jìn)一步改造4'-去甲基表鬼臼毒素獲得新的鬼臼類化合物，為抗腫瘤藥物篩選提供更多先導(dǎo)化合物。內(nèi)生微生物(細(xì)菌、放線菌和真菌等)普遍存在于植物組織內(nèi)，與宿主建立了密切的互惠共生關(guān)系。在這種復(fù)雜的相互作用中，內(nèi)生微生物究竟扮演何種角色仍然不清楚。本研究也許能為這種相互作用的分子調(diào)控機(jī)制的理論探討，以及轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物的微生物的實(shí)驗(yàn)篩選提供一條新的途徑。

圖6 CS-1對(duì)鬼臼毒素轉(zhuǎn)化途徑Fig.6 Podophyllotoxin transformation way by CS-1

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