葡枝根霉TP-02中的內(nèi)切葡聚糖苷酶基因在枯草芽胞桿菌WB600中的克隆和表達(dá)

黃輝，湯斌

(安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000)

纖維素是世界上最大的可再生資源，通過降解可轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物、化工原料，對(duì)于人類社會(huì)解決食物短缺和能源危機(jī)具有重大現(xiàn)實(shí)意義［1-3］。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶(cellulase)來分解和轉(zhuǎn)化纖維素則是纖維素利用的有效途徑。纖維素酶由內(nèi)切葡聚糖苷酶(EG)、外切葡聚糖苷酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)3種組分構(gòu)成［4-5］。各組分協(xié)同作用，可以將木質(zhì)纖維素水解為葡萄糖。其中EG優(yōu)先作用于無定形纖維素，切割β-1，4主鍵，進(jìn)而由外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶完成徹底降解［6］。目前，纖維素酶基因的克隆與表達(dá)的研究已經(jīng)成為纖維素酶分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)［7-8］。隨著纖維素酶分子生物學(xué)的研究不斷深入，越來越多的纖維素酶基因被克隆與表達(dá)。來源于纖維素降解微生物的纖維素酶基因的異源表達(dá)，使用最多的宿主就是大腸埃希菌和畢赤酵母。然而，在安全性、生產(chǎn)技術(shù)及蛋白分泌等方面，枯草芽胞桿菌比大腸埃希菌更具作為表達(dá)宿主的優(yōu)勢［9］。由于枯草芽胞桿菌自身分泌蛋白酶多，容易對(duì)獲得目的蛋白產(chǎn)生影響。本研究選擇缺失6種胞外蛋白酶基因(中性蛋白酶A、枯草溶菌素、胞外蛋白酶、金屬蛋白酶、桿菌肽酶F和中性蛋白酶B)的枯草芽胞桿菌WB600作為宿主菌，最終成功得到表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物葡枝根霉TP-02是從黃山生態(tài)林腐爛的枯草中篩選并保存［10］。用于雙鏈合成的含有HindⅢ酶切位點(diǎn)的錨定引物:5＇-(T)18AAGCTT(AG)10，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。pMA5和枯草芽胞桿菌WB600均為江南大學(xué)惠贈(zèng)?；虿僮飨嚓P(guān)的酶和試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基:葡萄糖-馬鈴薯培養(yǎng)基;纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基:CMC-Na 0.4%，KH2PO40.2%，(NH4)2SO40.14%，尿素0.03%，MgSO40.03%，CaCl20.03%，F(xiàn)eSO45 mg/L，MnSO41.56 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，CoCl22.0 mg/L，胰蛋白胨0.75 mg/L，酵母浸出物0.25 g/L;LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH 7.0;陽性克隆篩選培養(yǎng)基(LB-CMC-Na培養(yǎng)基):蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，CMC-Na 1%，瓊脂2%～3%，pH 7.1～7.2;重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC-Na 1.5%，(NH4)2SO40.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%。

1.2 方法

1.2.1 葡枝根霉TP-02總RNA的提取用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)活化葡枝根霉TP-02。然后用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)葡枝根霉產(chǎn)纖維素酶。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，加入L-山梨糖，終濃度為2 g/L。再繼續(xù)培養(yǎng)12 h。12 h后離心收集菌體。棄去上清液。用蒸餾水洗滌菌體2次，用液氮研磨。研磨后菌體用于總RNA抽提，用Trizol法提取總RNA［11］。

1.2.2 mRNA的分離將提取獲得的總RNA加入含有0.5 mg Oligo-dt cellulose的EP管中，室溫溫浴30 min，其間混勻數(shù)次。將溶液轉(zhuǎn)到含有吸附柱的1.5 mL的EP管中，4℃離心，加入10 μL RNA-Free水溶解獲得mRNA［12］。

1.2.3 cDNA的合成和雙酶切以葡枝根霉TP-02的mRNA做模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈cDNA。合成后純化，再用連接試劑盒將雙鏈與含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的接頭連接。用HindⅢ、EcoRⅠ酶酶切雙鏈cDNA。

1.2.4 pMA5質(zhì)粒的抽提和雙酶切在37℃轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)Escherichia coli DH5α，直到OD值達(dá)到0.5。4 000 r/min離心6 min，獲得菌體。用堿裂解法提取pMA5質(zhì)粒［13-14］。根據(jù)TaKaRa限制性內(nèi)切酶應(yīng)用手冊(cè)，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切質(zhì)粒。

1.2.5 cDNA文庫構(gòu)建和篩選用DNA連接試劑盒中連接酶連接雙酶切后的cDNA與雙酶切后的質(zhì)粒pMA5。上述連接產(chǎn)物用電極轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌WB600中。在LB平板上30℃培養(yǎng)重組枯草芽胞桿菌，直到重組子長出并獲得cDNA文庫。將在LB平板上生長的菌轉(zhuǎn)移到LB-CMC平板上37℃條件下培養(yǎng)2 d后將篩選得到的陽性克隆進(jìn)行序列測定。

1.2.6 枯草芽胞桿菌WB600及陽性克隆內(nèi)切葡聚糖苷酶的活性檢測在37℃和轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下，在250 mL含有50 mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)對(duì)應(yīng)序列的陽性克隆，培養(yǎng)到菌體的對(duì)數(shù)生長期。按5%的接種量將菌液接種到CMC-Na培養(yǎng)基中，在37℃和轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)。每隔6 h取1 mL培養(yǎng)液，測其內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活。分別取稀釋的酶液1 mL，與1 mL 1%的CMC-Na溶液(溶解于pH 4.8，0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液中)混合。50℃反應(yīng)30 min后，加入3 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻，加水定溶到25 mL。振蕩混勻后在520 nm測其OD值。1個(gè)單位的酶活(IU)被定義為每分鐘生成1 μmol的葡萄糖所需的酶量［15］。

1.2.7 內(nèi)切葡聚糖酶的純化和SDS-PAGE電泳

菌體在CMC-Na液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，收集上清液。用硫酸銨濃縮后，得到的沉淀用20 mmol/L的醋酸鹽溶解和透析。取5 mL處理好的發(fā)酵上清液上Sephadex G-100層析柱，用pH 4.8的0.1 mol/mL醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，洗脫速度為10 mL/h，每管收集4 mL，在280 nm測定各管光吸收值，并測定各管的內(nèi)切葡聚糖苷酶活力。每個(gè)樣品20 μL與蛋白質(zhì)沉降緩沖溶液混合，煮沸3 min，離心取上清點(diǎn)樣。膠用1%的考馬斯亮藍(lán)染色30 min，用40%的甲醇洗3次。通過與蛋白質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì)可以得出目的蛋白的分子量大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡枝根霉TP-02總RNA的1%凝膠電泳

圖1中泳道1和泳道2均為所提取的根霉TP-02的總RNA。從圖1中可以很清楚的看到總RNA的3條帶:5S、18S、28S。而且?guī)缀鯖]有降解，可以用于mRAN的分離。

圖1 根霉TP-02總RNAFig.1 Total RNA of Rhizopus stolonifer var.reflexus TP-02

2.2 pMA5質(zhì)粒圖譜

本研究選用了多克隆位點(diǎn)中的EcoRⅠ和HindⅢ2個(gè)酶切位點(diǎn)(圖2)。

圖2 pMA5質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of plasmid pMA5

2.3 陽性克隆的篩選

將cDNA文庫重組子涂布于LB-CMC平板上，形成單菌落后，用1%剛果紅溶液染色1 h，然后用1%的NaOH溶液進(jìn)行脫色固定染色圈。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)能和剛果紅發(fā)生劇烈反應(yīng)使得平板被染成紅色。重組菌能夠利用羧甲基纖維素鈉從而使得菌落周圍出現(xiàn)透明圈(圖3)，從而可以很便捷地篩選到陽性克隆。

圖3 陽性克隆篩選結(jié)果Fig.3 The result of positive clone screening

2.4 測序以及序列分析

將陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，經(jīng)測序獲得2個(gè)不同的序列，分別命名為eg2和eg3。其登錄號(hào)為HM043656和HM043657。經(jīng)NCBI比對(duì)，eg2與米根霉RCE3的內(nèi)切葡聚糖苷酶的相似性為65%，eg3與米根霉RCE1的內(nèi)切葡聚糖苷酶的相似性為67%。所以此2個(gè)序列為編碼內(nèi)切葡聚糖苷酶的新序列。

2.5 枯草芽胞桿菌WB600生長曲線

由圖4可知，枯草芽胞桿菌WB600沒有經(jīng)過延緩期，直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，0～8 h生長很快，9 h后生長速度逐漸變慢，32 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期，40 h后生長進(jìn)入衰退期。

圖4 枯草芽胞桿菌WB600的生長Fig.4 Growth of Bacillus subtilis WB600

2.6 枯草芽胞桿菌WB600及陽性克隆內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活測定

枯草芽胞桿菌WB600于37℃、150 r/min培養(yǎng)，每隔6 h取樣測定內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活，測定至72 h均未檢測到酶活，可以確定枯草芽胞桿菌WB600本身并不產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖苷酶。進(jìn)一步驗(yàn)證以上2個(gè)基因編碼內(nèi)切葡聚糖苷酶，在含有CMC-Na培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)陽性克隆，并每隔6 h測其酶活。圖5顯示出重組枯草芽胞桿菌WB600的發(fā)酵特性。發(fā)酵36 h后，重組枯草芽胞桿菌WB600的eg2與eg3編碼的內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活分別達(dá)到峰值為1.174和1.034 IU/mL。

圖5 eg2和eg3編碼的內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活Fig.5 Activity of endoglucanase coded by eg2 and eg3

圖6 根霉TP-02內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活Fig.6 Endoglucanase activity of Rhizopus TP-02

枯草芽胞桿菌作為宿主菌在安全性、生產(chǎn)技術(shù)和蛋白質(zhì)分泌等方面都比大腸埃希菌、畢赤酵母等要更好些，然而枯草芽胞桿菌自身分泌蛋白酶多，容易對(duì)獲得目的蛋白產(chǎn)生影響。本研究所用的枯草芽胞桿菌WB600是缺失6種胞外蛋白酶基因的枯草芽胞桿菌，大大減少了對(duì)目的蛋白的影響?？莶菅堪麠U菌是原核生物，生長繁殖和代謝能力都很強(qiáng)，從圖5和圖6可以看出，重組菌在36 h時(shí)酶活就達(dá)到了頂峰，而出發(fā)菌株根霉TP-02酶活達(dá)到最大值時(shí)的時(shí)間為90 h，發(fā)酵周期縮短了54 h。

2.7 SDS-PAGE電泳

柱純化后，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳。從圖7中，可以得出eg2和eg3編碼的蛋白的分子量大約分別在44和46 ku，并且條帶單一而且清晰。

圖7 SDS-PAGE電泳Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis

SDS-PAGE電泳條件:膠濃度:5%的濃縮膠，12%的分離膠;緩沖液:濃縮膠緩沖液為0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，分離膠緩沖液為1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，電極緩沖液為Tris 3 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，加重蒸水至1 000 mL，pH 8.3;電壓:180 V;染色劑:考馬斯亮藍(lán)R250。

3 討論

本研究利用構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫的方法成功分離出2種新的內(nèi)切葡聚糖苷酶基因(eg2和eg3)。通過發(fā)酵在36 h測得酶活最大值分別為1.174和1.034 IU/mL。發(fā)酵液經(jīng)純化分離后用SDS-PAGE電泳測得EGⅡ、EGⅢ分子量分別為44、46 ku。

本研究使用的宿主菌為缺失6種胞外蛋白酶基因的枯草芽胞桿菌WB600，降低了對(duì)目的蛋白降解的可能性，同時(shí)該表達(dá)為分泌性表達(dá)，也給目的蛋白的分離純化帶來了便利。

本研究雖然成功地進(jìn)行了異源表達(dá)并檢測到一定的活性，但是酶活力不是很理想。出現(xiàn)這種結(jié)果有以下幾個(gè)原因:①選用的2個(gè)酶切位點(diǎn)是位于MCS2，導(dǎo)致目的基因離啟動(dòng)子比較遠(yuǎn)，使得轉(zhuǎn)錄效率降低;②使用的pMA5載體拷貝數(shù)較低，使得目的基因的復(fù)制倍數(shù)較少，從而導(dǎo)致酶活不高。今后將從這兩方面著手繼續(xù)下面的研究。

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