復(fù)合微生態(tài)菌劑對(duì)黃瓜根際土壤微生物數(shù)量及酶活的影響

尹淑麗，張麗萍，張根偉，黃亞麗，崔冠慧，梁然，段普凡，程輝彩，麻耀華

(1.河北省科學(xué)院生物研究所，河北石家莊050081;2.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050081;3.鹿泉銅冶農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣區(qū)域站，河北石家莊050200)

作物土傳病害在世界各國(guó)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重，是一個(gè)世界性難以防治的植物病害，其黃瓜枯萎病的病原為鐮孢菌屬的尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，一般發(fā)病率為20%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%以上。研究表明，作物土傳病害的發(fā)生與根際土壤微生物的數(shù)量、組成和群落結(jié)構(gòu)關(guān)系密切［1-3］。近年來(lái)，人們利用微生態(tài)調(diào)控措施—施用有益微生物來(lái)改善根際微生態(tài)環(huán)境，達(dá)到促進(jìn)植物生長(zhǎng)和調(diào)控根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、減少和控制土傳病害發(fā)生的目的。對(duì)于施用有益微生物對(duì)根際土壤微生物種群數(shù)量的影響方面，馮莉等［4］利用熒光假單胞菌懸液處理煙草可于第1周提高土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量，同時(shí)提高根系活力。陳雪麗等［5］在黃瓜和番茄上施入2株芽胞桿菌可改變土壤中微生物菌群結(jié)構(gòu)。段春梅等［6］施用由3種放線(xiàn)菌組成的菌劑可顯著促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育。查仙芳等［7］于番茄上施入木霉菌劑可有效抑制土壤中土傳真菌病原菌種類(lèi)。而土壤中微生物類(lèi)群與土壤酶的活性密切相關(guān)［8-11］，土壤酶作為土壤質(zhì)量的生物活性指標(biāo)一直是土壤酶學(xué)研究的重點(diǎn)，并逐漸成為土壤微生物生態(tài)效應(yīng)研究重要方向和領(lǐng)域［12］，其活性的大小可以較敏感地反映土壤中生化反應(yīng)的方向和強(qiáng)度。目前復(fù)合微生態(tài)制劑的研究主要集中在2種微生物構(gòu)成的復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用效果及其生態(tài)效應(yīng)上，但關(guān)于由1株芽胞桿菌、1株鏈霉菌和1株綠色木霉菌株組成的復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑對(duì)根際土壤中微生物數(shù)量、土壤酶活的影響研究少有報(bào)道。本研究于移苗時(shí)施入該復(fù)合菌劑，采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)及土壤酶活測(cè)定方法，探討菌劑施入后黃瓜不同生育時(shí)期根際土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性的動(dòng)態(tài)變化，為該菌劑的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 作物品種黃瓜津春2號(hào)。

1.1.2 供試土壤特性pH為6.78，有機(jī)質(zhì)含量4.186%，全氮0.285%，速效磷1 239.46 mg/kg，速效鉀444.60 mg/kg。

1.1.3 復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑的制備枯草芽胞桿菌D、鏈霉菌317和綠色木霉采用適宜的方法單獨(dú)培養(yǎng)，最后收集芽胞及孢子，按孢子數(shù)1∶1∶1的比例復(fù)配，用80℃烘干24 h的草炭進(jìn)行吸附，最終使孢子數(shù)達(dá)1×109cfu/mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用盆栽試驗(yàn)，供試土壤為黃瓜連作土壤，加入適量蛭石(20%)，混勻后以相同的量(4.5 kg)裝入20 cm×25 cm的花盆中。5月24日于營(yíng)養(yǎng)缽中播種，6月12日選取長(zhǎng)勢(shì)一致的黃瓜進(jìn)行移栽定植，每穴中加入復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑20 g，對(duì)照處理加入相同量的草炭，統(tǒng)一管理。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，處理1為加入含水量20%的草炭20 g處理，處理2為加入復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑處理，處理3為空白對(duì)照處理，于黃瓜的苗期(6月22日)、花期(7月12日)、瓜期(8月1日)和拉秧期(8月21日)取黃瓜根際土壤，測(cè)定土壤中微生物數(shù)量及土壤酶活。

1.2.2 試驗(yàn)測(cè)定內(nèi)容及方法①根際土壤微生物數(shù)量的測(cè)定:稱(chēng)取10 g采集的新鮮根際土樣放入90 mL無(wú)菌水中，在搖床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩30 min將不同處理樣品液倍比稀釋涂布平板，(30±1)℃培養(yǎng)2～4 d后，記錄可培養(yǎng)真菌、放線(xiàn)菌、細(xì)菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量;②土壤酶活:將根際土壤自然蔭干，研磨過(guò)80目的篩子后，測(cè)定土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性。土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的NH3-N毫克數(shù)表示;過(guò)氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，以每克土消耗0.1 mol/L KMnO4毫升數(shù)表示;蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)表示;中性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的酚毫克數(shù)表示;③可培養(yǎng)微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì):測(cè)定土壤中細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量，微生物計(jì)數(shù)采用傳統(tǒng)的方法，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線(xiàn)菌采用改良髙氏1號(hào)培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，尖孢鐮刀菌采用選擇性培養(yǎng)基(參照KomadaH的方法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)根際土壤微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化的影響

由圖1～4可知，以草炭為吸附基質(zhì)對(duì)黃瓜不同生育時(shí)期土壤中細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量影響不大，與空白對(duì)照的變化趨勢(shì)相同，且差異不明顯。

土壤中細(xì)菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1，草炭和空白對(duì)照處理從苗期開(kāi)始至結(jié)瓜期根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，在瓜期細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大，于拉秧期達(dá)到整個(gè)生育期的最低。復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑處理在苗期根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量最大，可能因?yàn)閺?fù)合菌劑的施入一方面枯草芽胞桿菌在土壤中定殖，另一方面復(fù)合菌劑促進(jìn)根際土壤中細(xì)菌數(shù)量的繁殖;在瓜期又呈現(xiàn)一個(gè)小峰，在拉秧期細(xì)菌的數(shù)量降為最低，但除瓜期外各生育時(shí)期土壤中細(xì)菌數(shù)量均高于對(duì)照處理。本研究中3個(gè)處理均在瓜期細(xì)菌數(shù)量忽然增高，可能與此生育時(shí)期根際分泌物及根際環(huán)境有關(guān)。可見(jiàn)復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑的施入隨生育時(shí)期的延長(zhǎng)細(xì)菌數(shù)量出現(xiàn)波動(dòng)式的降低變化，可能因?yàn)殚_(kāi)始時(shí)復(fù)合微生態(tài)菌劑的施入，增加了土壤中細(xì)菌的數(shù)量，但隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)以及根際環(huán)境的變化，影響了菌劑中細(xì)菌的定殖及繁殖能力，使得數(shù)量降低。

圖1 根際土壤細(xì)菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 The dynamic changes of bacteria number in the inrhizosphere soil

土壤中真菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖2，草炭和空白對(duì)照處理根際土壤中真菌的數(shù)量在整個(gè)生育時(shí)期變化幅度很大，于花期真菌的數(shù)量降為最低;于瓜期、拉秧期真菌數(shù)量迅速增多，在拉秧期達(dá)到最高值，可能由于黃瓜不同生育時(shí)期，根際分泌物的成分不同，使得根際微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，影響了真菌的生長(zhǎng)和繁殖。復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑處理根際土壤中真菌的數(shù)量變化比較平穩(wěn)，在瓜期稍有提高，但在拉秧期土壤中真菌數(shù)量低于對(duì)照。

土壤中放線(xiàn)菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖3，3個(gè)處理根際土壤中放線(xiàn)菌的數(shù)量在整個(gè)生育時(shí)期的變化趨勢(shì)相同，在花期最多，于瓜期土壤中放線(xiàn)菌的數(shù)量降至最低，拉秧期稍有回升;復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑處理苗期至花期放線(xiàn)菌的數(shù)量變化平穩(wěn)，各生育時(shí)期根際土壤中放線(xiàn)菌的數(shù)量高于對(duì)照處理。

土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4，草炭和空白對(duì)照處理根際土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量的變化趨勢(shì)相同，在花期尖孢鐮刀菌的數(shù)量最低，在苗期和拉秧期的數(shù)量最大;復(fù)合土壤微生態(tài)處理根際土壤中真菌的數(shù)量基本處于平穩(wěn)變化狀態(tài)，拉秧期根際土壤中尖孢菌的數(shù)量低于空白對(duì)照處理。

圖2 根際土壤真菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamic changes of fungi number in the inrhizosphere soil

圖3 根際土壤放線(xiàn)菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 The dynamic changes of actinomycetes number in the inrhizosphere soil

圖4 根際土壤尖孢菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 The dynamic changes of Fusarium oxysporum number in the inrhizosphere soil

綜上可見(jiàn)，隨著花期放線(xiàn)菌數(shù)量的增多，細(xì)菌的數(shù)量最低，而土壤中真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量降為整個(gè)生育時(shí)期的最低值，可能因?yàn)榉啪€(xiàn)菌數(shù)量的增加抑制了土壤中真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量，同時(shí)對(duì)細(xì)菌的數(shù)量產(chǎn)生一定的影響;瓜期細(xì)菌數(shù)量增多，但放線(xiàn)菌數(shù)量減少，而土壤中真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量也增加，體現(xiàn)了土壤中放線(xiàn)菌的數(shù)量對(duì)真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響較大。由于復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑中含有放線(xiàn)菌、細(xì)菌和真菌，因此對(duì)土壤中真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響比較平緩，能夠保持土壤中自我緩沖的能力。但同時(shí)也體現(xiàn)出隨生育時(shí)期的延長(zhǎng)復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑的作用有所下降，不能在黃瓜整個(gè)生育時(shí)期一直起到積極的作用。

2.2 對(duì)根際土壤酶活性動(dòng)態(tài)變化的影響

土壤中中性磷酸酶活性動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖5，3個(gè)處理各生育時(shí)期中性磷酸酶活性的變化趨勢(shì)相同，從苗期開(kāi)始至拉秧期逐漸降低，于拉秧期達(dá)到最低值。其中草炭對(duì)照處理與空白對(duì)照處理的變化趨勢(shì)相同，且數(shù)值差異不明顯;土壤中施入復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑的處理各生育時(shí)期中性磷酸酶的活性均高于對(duì)照。

圖5 根際土壤中性磷酸酶的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 The dynamic changes of neutral phosphatase activity in the inrhizosphere soil

土壤中脲酶活性動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖6，草炭對(duì)照處理與空白對(duì)照處理的變化趨勢(shì)相同，由苗期開(kāi)始至拉秧期土壤中脲酶活性逐漸降低，且差異不明顯。土壤中施入復(fù)合土壤微生態(tài)制劑處理在花期土壤中脲酶的活性最高，其他時(shí)期與對(duì)照的變化趨勢(shì)相同，但除拉秧期外，其他各生育時(shí)期均明顯高于對(duì)照處理。

圖6 根際土壤脲酶的動(dòng)態(tài)變化Fig.6 The dynamic changes of urease activity in the inrhizosphere soil

圖7 根際土壤過(guò)氧化氫酶的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 The dynamic changes of catalase activity in the inrhizosphere soil

圖8 根際土壤蔗糖酶的動(dòng)態(tài)變化Fig.8 The dynamic changes of invertase activity in the inrhizosphere soil

土壤中過(guò)氧化氫酶活性動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖7，草炭對(duì)照處理與空白對(duì)照處理的變化趨勢(shì)相同，由苗期開(kāi)始至拉秧期過(guò)氧化氫酶的活性逐漸降低，且差異不明顯。土壤中施入復(fù)合土壤微生態(tài)制劑的處理在苗期、花期和瓜期與對(duì)照處理的變化趨勢(shì)相同，且差距不明顯;結(jié)瓜期和拉秧期變化平穩(wěn)。在苗期、花期和拉秧期土壤中過(guò)氧化氫酶活性高于對(duì)照。

土壤中蔗糖酶活性動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖8，草炭對(duì)照處理與空白對(duì)照處理的變化趨勢(shì)相同，且差異不明顯，花期土壤中蔗糖酶的活性最小;施入復(fù)合微生態(tài)菌劑處理，自苗期開(kāi)始至拉秧期土壤蔗糖酶活性呈現(xiàn)不斷增高的趨勢(shì)，于拉秧期達(dá)到最大值;瓜期和拉秧期土壤中蔗糖酶的活性明顯高于對(duì)照。

3 討論

3.1 對(duì)黃瓜根際土壤中微生物數(shù)量的影響

復(fù)合土壤微生態(tài)菌劑于移苗時(shí)施入土壤后，對(duì)不同生育時(shí)期黃瓜根際土壤中細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量變化的結(jié)果表明，菌劑施入苗期(菌劑施入后第10天)可明顯提高土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量，隨生育時(shí)期的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量的影響效果降低;但于花期后，與對(duì)照相比可明顯降低黃瓜根際土壤中真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量。與馮莉［4］施入熒光假單孢菌后第1周可提高煙草根際細(xì)菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量，3周后根際土壤中真菌數(shù)量顯著低于對(duì)照的結(jié)果相一致。復(fù)合菌劑的施入可使土壤向細(xì)菌型過(guò)渡，利于降低土傳真菌病害的發(fā)生，降低枯萎病的發(fā)生。

3.2 對(duì)黃瓜根際土壤中酶活的影響

復(fù)合微生態(tài)菌劑施入后，可于苗期、花期和瓜期明顯提高黃瓜根際土壤中中性磷酸酶和土壤脲酶的活性;于苗期、花期和拉秧期提高土壤中過(guò)氧化氫酶的活性;于瓜期、拉秧期提高土壤中蔗糖酶的活性?？梢?jiàn)復(fù)合微生態(tài)菌劑對(duì)不同土壤酶活的影響效果不同，但可提高土壤中相關(guān)酶活性，與趙萌［13］的研究結(jié)果相似。

復(fù)合微生態(tài)菌劑的施入可增加土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量，增加土壤酶活［13］。但隨黃瓜生育期的延長(zhǎng)影響效果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可見(jiàn)外來(lái)菌株引入土壤中適應(yīng)環(huán)境并大量定殖繁殖還受到土著菌株及土壤環(huán)境的影響。因此復(fù)合微生態(tài)菌劑要想達(dá)到理想的改善土壤及防病效果，需要在適宜時(shí)期進(jìn)行補(bǔ)施。

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