1株紅海欖根際纖維素降解真菌的分離鑒定及其酶學性質

潘虎，董俊德，盧向陽，田云，張偲，龍麗娟

(1.中國科學院南海海洋研究所中科院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，廣東廣州510301;2.中國科學院海南熱帶海洋生物實驗站，海南三亞572000;3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南長沙410128;4.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南長沙410128)

隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，化石燃料的供應日益緊缺，尋找和開發(fā)可再生能源和新能源成為世界各國的普遍共識。纖維素是地球上光合作用的初級產(chǎn)物，它占植物干重的35%～45%，每年全球生物合成的可再生性纖維素達1 000億t以上［1］。如何高效利用纖維素資源已成為關系國家能源安全的重要議題。由于微生物在纖維素利用方面的獨特優(yōu)勢，尋找新的纖維素利用菌種和開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶菌種，是纖維素資源高效利用的關鍵。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是處于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶，包括種類豐富的動物群落、紅樹木本植物群落、微生物群落的復雜而獨特的生態(tài)系統(tǒng)，在沿岸自然海洋生態(tài)系統(tǒng)中能維持較高的生產(chǎn)力水平，是海岸帶重要的濕地生態(tài)系統(tǒng)類型之一［2］。位于海洋、陸地交界處，由于潮間帶生境的高度鹽漬化、土壤的缺氧、高光輻射及周期性的海水浸淹，使其蘊涵大量的獨特微生物、酶和基因資源［3］。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中，植物凋落物、有機碎屑含量非常豐富，且蘊涵著大量的可以降解纖維素、木質素和幾丁質等大分子有機物的微生物。但由于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)被認識的相對較晚，對其微生物資源的組成、分布、功能和結構知之甚少。雖然國內外關于纖維素降解菌株的研究報道有很多［4-5］，但有關來源于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的纖維素降解微生物的研究報道卻很少。本文以我國海南三亞紅沙河流域紅樹林沉積物為研究對象，對分離得到的1株產(chǎn)纖維素酶真菌進行了形態(tài)學、分子生物學的鑒定及其酶學特性研究。旨在為我國本土紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中纖維素降解真菌的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品采集樣品采集于2010年8月，為中國海南省三亞市紅沙河口(18°13＇50.2″N，109°37＇15.8″E)紅樹林區(qū)紅海欖Rhizophora stylosa植株根際0～30 cm深的土壤沉積物。樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，立即帶回實驗室4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基①分離培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1.5 g，剛果紅0.2 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌后等培養(yǎng)基冷卻至60℃加入過濾除菌的100 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素各1 mL;②改良PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮，挖芽眼，洗凈，切片。稱200 g放入1 000 mL自來水中，用文火煮沸30 min，雙層紗布過濾)，蔗糖20.0 g，NaCl 1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容到1 000 mL;③發(fā)酵培養(yǎng)基:CMC-Na 10.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母提取物2.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選［6］將樣品混勻后取約5 g置于含50 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中，30℃、150 r/min震蕩搖勻15 min，靜置30 s后取1 mL菌液梯度稀釋至10-3、10-4、10-5，涂布于分離培養(yǎng)基上，接種量為0.05 mL，每1處理設3個重復。30℃培養(yǎng)2～3 d，從有明顯水解透明圈的菌落邊緣小心挑出菌絲接種到改良PDA培養(yǎng)基上，反復接種數(shù)代直至獲得純培養(yǎng)物。最終篩選到1株有明顯水解透明圈的真菌，命名為Z-2-4。

1.2.2 菌種鑒定①形態(tài)學鑒定:真菌形態(tài)學鑒定依據(jù)魏景超編著的《真菌鑒定手冊》［7］;②基因組DNA提取及ITS、β-微管蛋白、鈣調節(jié)蛋白基因的擴增和測序:對獲得的純培養(yǎng)物菌株使用BIOMIGA真菌基因組抽提試劑盒提取總DNA，然后用于目的基因的擴增。真菌ITS區(qū)部分序列的擴增采用通用引物ITS1/ITS4［8］、β-微管蛋白(β-tubulin)序列的擴增采用通用引物Bt2a/Bt2b［9］、鈣調節(jié)蛋白(calmodulin)序列的擴增采用通用引物cmd5/cmd6［10］。擴增程序如下:94℃5 min;94℃45 s，54℃45 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳進行產(chǎn)物檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送交測序公司測序，利用BLAST軟件將測定得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，獲取相近典型菌株的基因序列，然后用CLUSTAL X軟件進行全序列比對，利用MEGA3.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系統(tǒng)發(fā)育樹［11］。

1.2.3 粗酶液的制備及纖維素酶活(CMC酶活)的測定［12-13］將純化菌種接種到PDA平板上培養(yǎng)3 d，用6 mm打孔器打孔，取3塊含純化菌種的瓊脂塊接種到裝有200 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、225 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液于4℃、6 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。將其置于25 mL的具塞刻度玻璃試管中，加入0.5 mL適當稀釋的酶液，50℃恒溫水浴預熱2 min后，加入2.0 mL用pH 4.8醋酸緩沖液配制的1%羧甲基纖維素鈉溶液，50℃恒溫水浴酶解30 min，然后加入2.5 mL的DNS于沸水浴中5 min，流水冷卻后定容至25 mL混勻，在520 nm下測定其吸光值，對照標準曲線后測算酶活力。酶活力按照國際單位規(guī)定定義為每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

2 結果與分析

2.1 菌株Z-2-4形態(tài)學特征

菌株Z-2-4在PDA平板培養(yǎng)基上生長較快，30℃條件下培養(yǎng)3 d菌落直徑達35～40 mm，菌落呈圓形，有放射狀溝紋，形成同心環(huán)紋，邊緣白色，中間淺黃色，氣生菌絲茂盛，菌落背面呈黃色(圖1A)。分生孢子頭球形，直徑40～50 μm，分生孢子近球形，直徑2.0～2.5 μm，壁粗糙(圖1C)。將該菌株接種到羧甲基纖維素鈉-剛果紅平板培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)3 d后，可形成直徑25 mm的水解透明圈，表明該菌株具有較高的纖維素降解活性(圖1B)。根據(jù)《真菌鑒定手冊》，菌株Z-2-4依形態(tài)學特征初步鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。

圖1 菌株Z-2-4形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristic of Z-2-4 strain

2.2 菌株ITS、β-微管蛋白、鈣調節(jié)蛋白基因序列分析

為了進一步確定該菌的分類地位，在形態(tài)學的基礎上對其進行了分子生物學鑒定。用通用引物擴增其ITS、β-微管蛋白、鈣調節(jié)蛋白基因并進行測序分析，將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，選取同源性較高的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖2、3、4。結果顯示:該菌的ITS序列與其親緣關系最近的Aspergillus insulicola(EF661430.1)只有94%的相似性，β-微管蛋白序列與Aspergillus insulicola(FR775320.1)的相似性為89%，鈣調節(jié)蛋白序列與Aspergillus insulicola(EF661396.1)的相似性為93%，推測該菌為Aspergillus屬的一個潛在新種。

圖2 菌株Z-2-4的ITS rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the ITS rRNA sequences

圖3 菌株Z-2-4的β-tubulin基因序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the β-tubulin sequences

圖4 菌株Z-2-4的calmodulin基因序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Z-2-4 based on the calmodulin sequences

2.3 菌株Z-2-4粗酶液酶學性質的初步研究

2.3.1 溫度對CMC酶活力的影響為明確菌株Z-2-4分泌的纖維素酶最佳反應溫度，調節(jié)溫度分別為20、25、30、35、40、45、50、60、70、80℃，pH值為7.0，測定不同溫度下的酶活力。以最高值為100%，用相對酶活力對溫度作圖(圖5)。從圖5中可以看出，菌株Z-2-4所分泌的纖維素酶在30～60℃下，具有較高的相對酶活力，在80℃下相對酶活仍約有50%，表明此纖維素酶具有較高的耐高溫能力。此菌分泌的胞外纖維素酶最佳反應溫度條件為40℃。

圖5 溫度對菌株Z-2-4酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the enzyme activity of Z-2-4 strain

2.3.2 pH值對CMC酶活力的影響為明確菌株Z-2-4纖維素酶反應最適pH值，用pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖溶液配置1%的CMC底物溶液，測定不同pH值下的CMC酶活力。以最高值為100%，用相對酶活力對溫度作圖(圖6)。從圖6中可以看出，菌株Z-2-4所分泌的纖維素酶在pH 4.0～8.0均有較高的相對酶活力，達到70%～100%。說明此菌分泌的纖維素酶適應pH值較寬，其中最適pH值為6.0。

圖6 pH值對菌株Z-2-4酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on the enzyme activity of Z-2-4 strain

2.3.3 不同發(fā)酵時間對CMC酶活力的影響將純化菌種接種到PDA平板上培養(yǎng)3 d，用6 mm打孔器打孔，取3塊含純化菌種的瓊脂塊接種到裝有200 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、225 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，然后分別在1、2、3、4、5、6、7 d取粗酶液在40℃、pH 6.0條件下測定其CMC酶活。從圖7中可以看出，該菌從第2天開始大量產(chǎn)酶，CMC酶活迅速升高，在第4天達到最高值2.57 U/mL，隨后CMC酶活逐漸降低。纖維素酶是一種誘導酶，只有當酶的作用底物或其類似物存在時才能合成。當菌種剛接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中時，由于菌體主要進行自身的繁殖以及其細胞內編碼纖維素酶的基因表達較低，故其初期酶活較低;隨后纖維素酶得到大量表達，其酶活性在短時間內迅速升高;最后，由于底物的消耗以及代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用使纖維素酶的表達受到抑制，纖維素酶活隨之逐漸降低。

圖7 時間對菌株Z-2-4酶活力的影響Fig.7 Effects of incubation time on the enzyme activity of Z-2-4 strain

3 討論

在自然界中，許多細菌、真菌、放線菌、原生動物等都能產(chǎn)纖維素酶。但細菌、放線菌和原生動物所產(chǎn)纖維素酶量較少、纖維素酶系不完全且多數(shù)屬于胞內酶;而絲狀真菌所產(chǎn)纖維素酶為胞外酶、產(chǎn)酶效率高且纖維素酶系較完善。故國內外關于產(chǎn)纖維素酶菌種的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、米曲霉等。曲霉屬菌株在自然界分布廣泛，是重要的發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的菌種，現(xiàn)已被利用的多達60余種。目前，國內外有關曲霉屬產(chǎn)纖維素酶的研究報道較多，且主要集中于黑曲霉(Aspergillus niger)［14-15］，而來源于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的產(chǎn)纖維素酶曲霉卻未見報道。本文從海南省三亞市紅沙河口紅海欖植物根際土壤中分離篩選得到1株纖維素降解真菌，命名為Z-2-4。形態(tài)學初步鑒定結果為曲霉屬(Aspergillus sp.)，其ITS、β-微管蛋白、鈣調節(jié)蛋白基因序列與其親緣關系最近菌株的相似性分別為94%、89%和93%。推測該菌為Aspergillus屬的一個潛在新種。菌株Z-2-4所產(chǎn)纖維素酶的最佳反應溫度為40℃，最佳反應pH值為6.0，產(chǎn)纖維素酶活力最高出現(xiàn)在發(fā)酵第4天時，達到2.57 U/mL。該菌分泌的胞外纖維素酶具有較強的耐高溫能力以及較好的pH值穩(wěn)定性，具有廣闊的工業(yè)應用前景。

致謝感謝中國科學院海洋微生物研究中心資源與信息庫對本研究的大力支持。

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