湖南郴州非綜合征型聾患者GJB2、SLC26A4和線粒體DNA12SrRNA基因突變分析△

胡鵬 鄧忠 譚東輝 賴若沙 朱發(fā)梅 謝鼎華

耳聾是造成人類殘疾的最常見原因，目前我國(guó)有117萬(wàn)聾兒，其中7歲以下聾兒有80多萬(wàn)，約60%是遺傳性聾[1]。70%的遺傳性聾是非綜合征型聾，不伴其它器官癥狀。國(guó)內(nèi)大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明：縫隙連接蛋白2 (gap junction beta 2, GJB2)、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族26類4號(hào)(solute carrier family 26 member 4, SLC26A4) 和線粒體DNA12SrRNA基因是最常見的3個(gè)非綜合征型耳聾基因[1]。本研究采用耳聾基因芯片聯(lián)合DNA測(cè)序法對(duì)湖南郴州地區(qū)154例非綜合征型聾患者實(shí)施這3個(gè)基因的突變檢測(cè)，探討該基因芯片用于臨床的適用性，并分析該地區(qū)非綜合征型遺傳性聾的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 本研究調(diào)查對(duì)象為2010年9月至2011年3月間就讀于湖南郴州聾啞學(xué)校的學(xué)生及在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診的均診斷為非綜合征型聾的患者154人，均為漢族，男85例，女69例，年齡3～14歲，平均7.8±3.6歲。來(lái)自中國(guó)郴州地區(qū)的154個(gè)家庭，在調(diào)查前得到患者家屬的正式同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床資料采集 通過(guò)患兒家長(zhǎng)填寫問(wèn)卷式調(diào)查表獲取患兒的出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史(聾前傳染病史、耳毒性藥物應(yīng)用情況、頭部外傷史等)、母親孕期情況等。對(duì)患者進(jìn)行全身檢查排除綜合征型聾，同時(shí)進(jìn)行耳科體檢、聽力檢測(cè)及耳部影像學(xué)檢查等，排除中耳炎和外傷等其他致聾因素。聽力檢測(cè)顯示患者均為重度以上(聽力損失大于61 dB)的雙側(cè)感音神經(jīng)性聾。

1.2.2DNA提取 用含EDTA抗凝劑的真空采血管采集受檢者外周血5 ml，應(yīng)用試劑盒(北京天根生物工程有限公司)提取DNA，提取步驟參照試劑盒提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測(cè)后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用耳聾基因芯片(北京博奧生物有限公司)進(jìn)行遺傳性聾基因突變熱點(diǎn)篩查，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。該芯片可檢測(cè)國(guó)人中常見的4個(gè)耳聾基因中的9個(gè)熱點(diǎn)突變，包括GJB2(35delG、176del16bp、235delC及299delAT)、GJB3(538C>T)、SLC26A4 (IVS7- 2A>G及2168A>G)和線粒體DNA12SrRNA(1494C>T及1555A>G)。

1.2.4GJB2基因序列檢測(cè) 對(duì)基因芯片檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)GJB2基因突變和僅發(fā)現(xiàn)單個(gè)雜合突變的患者進(jìn)行GJB2基因的測(cè)序。由于GJB2基因的蛋白編碼序列僅存在于第2外顯子上，采用文獻(xiàn)報(bào)道的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增GJB2基因第2個(gè)外顯子[2]，引物由南京金斯瑞生物公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μl：DNA模板(20 mg/L)4 μl，正反向引物(100 mg/L)各2 μl，2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)25 μl，ddH2O加至50 μl。95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。經(jīng)電泳檢測(cè)產(chǎn)物特異性好的，送南京金斯瑞測(cè)序公司純化及測(cè)序。

1.2.5SLC26A4基因序列檢測(cè) 對(duì)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因的IVS7-2A>G或2168A>G(H723R)突變的患者標(biāo)本進(jìn)行SLC26A4基因的測(cè)序。SLC26A4基因共21個(gè)外顯子，其中開放閱讀框共20個(gè)外顯子，不包括第1號(hào)外顯子。本研究采用文獻(xiàn)中報(bào)道的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序[2]，其中7、8外顯子同在一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)，11、12外顯子在一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)。共擴(kuò)增18個(gè)片段以覆蓋SLC26A4全部cDNA序列及每個(gè)外顯子前后的剪切區(qū)序列。采用以下檢測(cè)策略：先檢測(cè)SLC26A4基因突變熱點(diǎn)區(qū)域第7、8號(hào)外顯子(擴(kuò)增子包括第7、8號(hào)外顯子以及兩者之間的內(nèi)含子)，還有第19外顯子以驗(yàn)證基因芯片的準(zhǔn)確性；如果發(fā)現(xiàn)純合或復(fù)合雜合突變即停止檢測(cè)，如果未發(fā)現(xiàn)突變或發(fā)現(xiàn)單雜合突變則先篩查第3、10、17、15號(hào)外顯子，然后檢測(cè)剩余外顯子，直至發(fā)現(xiàn)另一個(gè)突變或檢測(cè)完全部外顯子。

PCR反應(yīng)體系同GJB2基因序列檢測(cè)。第7、8外顯子反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)終止后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。其它外顯子反應(yīng)條件同第7、8號(hào)外顯子基本一致，只是復(fù)性溫度為60 ℃。PCR產(chǎn)物送純化后測(cè)序。

1.2.6序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件包中的Seqman軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析，將測(cè)序結(jié)果與Genebank的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包對(duì)基因芯片法和DNA測(cè)序法檢測(cè)GJB2基因突變的檢出率進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)(McNemar檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1基因芯片檢測(cè)結(jié)果 基因芯片法共檢出26例患者有GJB2基因突變，檢出率為16.88%(26/154)，包括純合突變9例(235delC純合8例，299delAT純合1例)，復(fù)合雜合突變10例(235delC+299delAT復(fù)合雜合9例，235delC+176del16復(fù)合雜合1例)，單純雜合突變7例(235delC雜合3例，299delAT雜合4例)。另外檢出10例(6.49%，10/154)SLC26A4基因突變，包括IVS7-2A>G雜合突變8例，H723R雜合突變2例。還檢出3例患者線粒體DNA12SrRNA基因突變，檢出率為1.95%(3/154)，包括1555A>G突變2例(1.30%)，1494C>T突變1例(0.65%)；這3例患者沒(méi)有明確的耳毒性藥物應(yīng)用史，其中2例有母系遺傳的家族史。所有患者未檢出GJB3基因538C>T突變。

基因芯片法共確診22例，其中，19例為GJB2基因突變導(dǎo)致遺傳性聾(純合突變9例和復(fù)合雜合突變10例)，3例為線粒體基因突變導(dǎo)致。SLC26A4基因突變的患者需進(jìn)一步測(cè)序才能確診。

2.2DNA測(cè)序結(jié)果 對(duì)基因芯片確診的部分標(biāo)本進(jìn)行GJB2基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，符合率為100%。對(duì)基因芯片法未能確診的患者標(biāo)本進(jìn)行基因測(cè)序，又發(fā)現(xiàn)GJB2純合突變1例(109A>G純合)，復(fù)合雜合突變1例(235delC+109A>G，本例已由基因芯片診斷為235delC單雜合突變)，單雜合突變7例(109G>A突變3例，139G>A突變1例，368C>A突變2例，439G>A突變1例)，其中2例(純合突變1例，復(fù)合雜合突變1例)確診為GJB2致聾。

兩種方法共檢測(cè)出34例患者有GJB2基因突變，突變檢出率為22.08%(34/154)，其中純合突變10例，復(fù)合雜合突變11例，單雜合突變13例；21例(13.64%，21/154)GJB2基因純合或復(fù)合雜合突變確診為GJB2基致聾，共檢測(cè)出7種GJB2基因突變(235delC、299delAT、176del16、109G>A、139G>A、368C>A、439G>A)，均為文獻(xiàn)及The connexin-deafness homepage已經(jīng)報(bào)道的突變[3]，同時(shí)還檢出3種文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的多態(tài)(79G>A、341G>A、608T>C)[3,4]。GJB2基因檢測(cè)結(jié)果見表1。

對(duì)基因芯片檢出SLC26A4基因單雜合突變的10例標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，在6例標(biāo)本中檢測(cè)出了該基因另一個(gè)突變，證實(shí)為復(fù)合雜合突變，檢出率3.90%(6/154)，另外4例未檢測(cè)出另一突變。這10例均行顳骨高分辨率CT(HRCT)或MRI檢查，6例復(fù)合雜合突變者證實(shí)均為大前庭水管綜合征，4例單純雜合突變的患者中2人有前庭水管擴(kuò)大，另2人未見異常。兩種方法共發(fā)現(xiàn)7種SLC26A4基因突變， 其中 6 種為報(bào)道過(guò)的突變(S391R、T410M、IVS15+5G>A、IVS7-2A>G、T94I和H723R)[5,6]，另一種為新發(fā)現(xiàn)的突變Q696X，是第18號(hào)外顯子2086位點(diǎn)的胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?2086C>T)，導(dǎo)致編碼的696位上的谷氨酰胺改變?yōu)榻K止密碼子(圖1)。該突變的先證者為IVS7-2A>G和Q696X復(fù)合雜合突變，表現(xiàn)為前庭水管擴(kuò)大伴極重度聾，其父母基因型分別為IVS7-2A>G和Q696X的單雜合子，聽力正常。由于該突變與耳聾表型相關(guān)，而且對(duì)100例正常人DNA樣本18號(hào)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，未檢測(cè)出相同突變，故認(rèn)為Q696X是一個(gè)新的致聾突變而非多態(tài)。

在發(fā)現(xiàn)的10例SLC26A4基因突變者中，IVS7-2A>G所占的比例最高，達(dá)5.19%(8/154)，其次為H723R和T410M，各2例，檢出率均為1.30%(2/154)。10例患者的臨床表現(xiàn)和SLC26A4基因檢測(cè)結(jié)果見表2。

表1 154例患者GJB2基因突變檢測(cè)結(jié)果

圖1 突變2086C>T(Q696X)正向測(cè)序圖:左---野生型；右---突變型雜合子

表2 10例SLC26A4基因突變患者臨床表現(xiàn)和基因型

2.3基因芯片法及DNA測(cè)序法測(cè)得的基因突變檢出率比較 154例患者用基因芯片法檢測(cè)GJB2基因突變的檢出率為16.88%，DNA測(cè)序法的檢出率為22.08%，兩種方法檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.325，P=0.25)。

3 討論

遺傳性聾具有高度的基因異質(zhì)性，與耳聾有關(guān)的基因多達(dá)200多種，給病因診斷帶來(lái)很大困難。不過(guò)，中國(guó)人中最常見的GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA 3種致聾基因都有突變熱點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)針對(duì)這些特點(diǎn)開發(fā)了遺傳性耳聾基因芯片，并用其檢測(cè)了大批患者[7]，本研究證實(shí)了該芯片的可靠性和實(shí)用性。

GJB2是發(fā)病率最高的遺傳性聾致聾基因，在中國(guó)人遺傳性聾患者中GJB2基因突變攜帶率約為21%[8]。本組對(duì)象中GJB2基因的突變率為22.08%，其中235delC是最常見的突變類型，與文獻(xiàn)相吻合[9]。本組患者299delAT突變檢出率僅次于235delC，說(shuō)明109G>A突變也是本地區(qū)的另一個(gè)熱點(diǎn)突變，可以考慮在基因芯片中增加該位點(diǎn)的檢測(cè)。由于基因芯片快速、準(zhǔn)確和低成本的優(yōu)點(diǎn)，可用于GJB2基因的篩查，但由于基因芯片不能發(fā)現(xiàn)新的和少見的突變，還不能完全取代DNA測(cè)序。

SLC26A4基因型具有明顯的種族特異性，在中國(guó)人大前庭水管綜合征患者中最常見的SLC26A4基因突變類型是IVS7-2A>G，其次為H723R[12]。本研究應(yīng)用基因芯片進(jìn)行SLC26A4基因的快速篩查，發(fā)現(xiàn)IVS7-2A>G突變?cè)诒镜貐^(qū)非綜合征型聾患者中攜帶率為5.19%，H723R突變攜帶率為1.30%；2名大前庭水管征患者只檢測(cè)出SLC26A4基因單個(gè)雜合突變，推測(cè)可能在患者基因的調(diào)控區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域有另一個(gè)突變；其余具有SLC26A4基因單純雜合突變，但沒(méi)有大前庭水管征表現(xiàn)的患者，則可能是由于其他原因致聾。

SLC26A4基因有21個(gè)外顯子，對(duì)患者的所有外顯子測(cè)序費(fèi)時(shí)費(fèi)力。根據(jù)中國(guó)人大前庭水管綜合征患者中IVS7-2A>G和H723R兩種突變高發(fā)的特點(diǎn)，本研究用基因芯片篩查這兩種突變的攜帶者后，再進(jìn)行SLC26A4基因測(cè)序和影像學(xué)檢查確定是否為大前庭水管征患者。由于部分患者缺少這兩種突變，因此基因芯片法有一定的漏診率。

本研究共發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因的7種突變，6種為報(bào)道過(guò)的突變(T94I、S391R、T410M、H723R、IVS7-2A>G和IVS15+5G>A)，分別位于SLC26A4基因的第3、10、19外顯子和第7、15內(nèi)含子上；IVS7-2A>G和IVS15+5G>A為剪接區(qū)突變，其突變使前體mRNA不能正常剪接，影響Pendrin的翻譯。4種錯(cuò)義突變(T94I、S391R、T410M、和H723R)可導(dǎo)致編碼的氨基酸改變，影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能[13]。本研究新發(fā)現(xiàn)的無(wú)義突變Q696X是第18號(hào)外顯子2086位胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?，?dǎo)致編碼的696位上的谷氨酰胺改變?yōu)榻K止密碼子，使蛋白質(zhì)的翻譯提前終止，推測(cè)其可導(dǎo)致Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能損害。這一新發(fā)現(xiàn)的突變對(duì)大前庭水管征的病因研究具有重要意義。

本次研究還檢出3例患者線粒體DNA12SrRNA基因突變，包括1555A>G均質(zhì)突變2例，1494C>T均質(zhì)突變1例。這3例患者沒(méi)有明確的耳毒性藥物應(yīng)用史，不過(guò)其中2例有母系遺傳的家族史。1555A>G突變可以導(dǎo)致氨基糖苷類藥物相關(guān)的感音神經(jīng)性聾，氨基糖苷類藥物致聾有兩種情況：一是用藥過(guò)量；二是正常用藥或是僅用少量的藥物就導(dǎo)致耳聾，即所謂“一針致聾”，后一類患者大多是線粒體基因突變的攜帶者[14]。1555A>G突變改變了人類線粒體小rRNA亞單位一個(gè)保守區(qū)域，增強(qiáng)了氨基糖苷類抗生素與線粒體核糖體的結(jié)合，破壞了線粒體蛋白質(zhì)合成，減少ATP生成，導(dǎo)致毛細(xì)胞死亡。1555A>G是導(dǎo)致耳聾的最常見線粒體基因突變，據(jù)報(bào)道在中國(guó)人中的陽(yáng)性率為1%～3%[14]。本研究在郴州地區(qū)非綜合征型聾患者中1555A>G突變檢出率為1.30%，與我國(guó)大部分地區(qū)的陽(yáng)性率一致[8.12,15]。另一個(gè)藥物敏感致聾靶點(diǎn)1494C>T突變的檢出率為0.65%。對(duì)線粒體DNA12SrRNA基因突變的患者進(jìn)行早期診斷，可以給其家族內(nèi)的母系成員早期預(yù)防和干預(yù)，避免應(yīng)用氨基糖苷類藥物，降低藥物性聾的發(fā)生率。

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