3.6-mT正弦交變電磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響

周 建，王嘉琪，葛寶豐，馬小妮，陳克明，韋 哲

中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 1骨科研究所 2醫(yī)學(xué)工程科， 蘭州 730050

3.6-mT正弦交變電磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響

周 建1，王嘉琪1，葛寶豐1，馬小妮1，陳克明1，韋 哲2

中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院1骨科研究所2醫(yī)學(xué)工程科， 蘭州 730050

目的研究正弦交變電磁場(chǎng) (SEMFs)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。方法體外分離培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞，傳代后隨機(jī)分為6組，分別用頻率50 Hz、強(qiáng)度為3.6 mT SEMFs處理，處理時(shí)間分別為每天0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。結(jié)果SEMFs處理后3～5 d，細(xì)胞呈現(xiàn)特征樣分布。SEMFs處理后9 d，0.5 h組堿性磷酸酶(ALP)活性顯著增加，ALP組織化學(xué)染色和鈣化結(jié)節(jié)面積結(jié)果與ALP活性一致。在SEMFs處理后48 h和96 h，骨保護(hù)素和膠原ⅠmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，尤以0.5 h組最明顯。結(jié)論50 Hz、3.6 mT SEMFs可抑制成骨細(xì)胞增殖，但能促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化成熟。

成骨細(xì)胞;正弦交變電磁場(chǎng);膠原Ⅰ;骨保護(hù)素

自從骨骼的壓電效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，電磁場(chǎng)被應(yīng)用于臨床骨折延遲愈合、骨不連接和骨質(zhì)疏松等骨病的治療已有30多年時(shí)間［1］。雖然電磁的骨病治療已有如此長(zhǎng)的應(yīng)用時(shí)間，但其作用機(jī)制和應(yīng)用的磁場(chǎng)參數(shù)選擇還存在很大分歧［2］。文獻(xiàn)報(bào)道磁場(chǎng)效應(yīng)存在一個(gè)非線性效應(yīng)窗口［3］，同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，3.6 mT為正弦交變磁場(chǎng)的一個(gè)強(qiáng)度效應(yīng)窗口［4］。本研究評(píng)估了50 Hz 3.6 mT不同處理時(shí)間的正弦交變電磁場(chǎng) (sinusoidal electromagnetic fields，SEMFs)對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響，以期為電磁場(chǎng)應(yīng)用于骨痛、骨折延遲愈合，骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病的治療提供一個(gè)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

材料 出生48 h以內(nèi)的SPF級(jí)SD大鼠 ［甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK(甘)2004-0006-152］，胎牛血清 (蘭州民海生物公司)，α-MEM培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶 (Gibco公司，美國(guó))，RNAiso Reagent kit、 TakaRa Prime ScriptTMSYBR?Premix Ex TaqTMⅡPCR擴(kuò)增試劑盒 (大連寶生物公司)，地塞米松、磷酸化抗壞血酸、β-磷酸甘油鈉、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶 (Sigma公司，美國(guó))，茜素紅 (上海生工)。

正弦交變磁場(chǎng)發(fā)生儀 實(shí)驗(yàn)所用磁場(chǎng)發(fā)生儀由本實(shí)驗(yàn)組與蘭州理工大學(xué)共同研制，線圈內(nèi)徑為180 mm，頻率、磁感應(yīng)強(qiáng)度均精確可調(diào)。磁感應(yīng)信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)控制程序產(chǎn)生后，經(jīng)過(guò)信號(hào)放大器放大后傳入磁場(chǎng)線圈，磁場(chǎng)發(fā)生裝置各部分組成見圖1。經(jīng)中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)醫(yī)學(xué)計(jì)量測(cè)試研究站測(cè)定表明，磁場(chǎng)發(fā)生儀運(yùn)行期間磁場(chǎng)環(huán)境均勻穩(wěn)定，報(bào)告編號(hào):醫(yī)計(jì)磁字ccqd-2008-01。儀器經(jīng)紫外線照射消毒后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，由導(dǎo)線與外部控制裝置相連。實(shí)驗(yàn)期間培養(yǎng)箱內(nèi)溫度控制在 (37±0.2)℃。

成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取出生48 h以內(nèi)SD大鼠10只，處死后放入75%乙醇溶液浸泡10 min，取顱骨，去除骨膜、血管及結(jié)締組織，PBS漂洗。將顱骨剪成約1 mm×1mm大小的骨片，加入0.25%胰蛋白酶2～3 ml，37℃預(yù)消化10 min，棄消化液后重復(fù)1次;PBS漂洗骨片，換0.1% Ⅱ型膠原酶消化，37℃水浴消化4次，第1次10 min棄消化液，以后每次20 min，收集并合并消化液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液1000 r/min離心5 min，沉淀用PBS漂洗后用含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液懸浮，吹打均勻后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)細(xì)胞/ml，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

細(xì)胞分組與磁場(chǎng)處理 將第1代傳代細(xì)胞 (P1)調(diào)整濃度至3×104個(gè)細(xì)胞/ml接種于60 mm培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為6組，依次置于50 Hz，0 mT(對(duì)照組)和3.6 mT(處理組，處理時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)。

增殖分析 P1代細(xì)胞接種12 h后采用磁場(chǎng)處理，其中0 h不用任何磁場(chǎng)處理，用作對(duì)照組。48、72、96 h后換含0.5%MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入DMSO搖床震蕩10 min，待紫色結(jié)晶沉淀徹底溶解后于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值 (optical density，OD)。

圖1 磁場(chǎng)原理示意圖Fig 1 Schematic representation of the electromagnetic fields device

成骨細(xì)胞成熟分化分析 將P1代細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，每3天換液1次，待細(xì)胞70%～80%融合成片時(shí)加入成骨性誘導(dǎo)劑 (50 mg/L磷酸化抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和1×10-8mol/L的地塞米松)，開始磁場(chǎng)處理。

堿性磷酸酶活性測(cè)定:第3、6、9和12天分別測(cè)定各組堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)活性，ALP活性測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書操作，每組分別按緩沖液∶基質(zhì)液=1∶1加入充分搖勻;然后37℃水浴15 min，加入3倍于基質(zhì)液顯色液，充分混勻顯色后，測(cè)定507 nm處OD值，換算成金氏單位。

茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色:磁場(chǎng)處理第10天，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，加入10%甲醛溶液固定10 min，棄固定液，加入 pH 8.9、0.1%的茜素紅染色液，37℃水浴1 h，流動(dòng)水沖洗，換固定液照相記錄結(jié)果。照相后采用Image-Pro Plus 6.0灰度分析軟件，掃描鈣化結(jié)節(jié)染色區(qū)域的面積，應(yīng)用公式:培養(yǎng)皿的面積× (鈣化結(jié)節(jié)染色區(qū)域掃描面積/照片中培養(yǎng)皿的掃描面積)。

基因表達(dá)水平分析

總RNA提取:P1代細(xì)胞在第1次磁場(chǎng)處理后24、72、96 h后棄培養(yǎng)液，加入無(wú)酶PBS漂洗2次，加入1 ml RNAiso Reagent Kit裂解細(xì)胞，收集裂解液后加入200 μl氯仿4℃ 13 500 r/min離心15 min，取上清液加入等體積的異丙醇冰上靜置15 min，4℃13 500 r/min離心15 min棄上清液，75%乙醇重懸浮沉淀4℃ 13 500 r/min離心5 min，棄上清后 -70℃保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，測(cè)定OD260nm、OD280nm、OD320nm、OD230nm值，調(diào)整總RNA的濃度。

逆轉(zhuǎn)錄:使用TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit(TakaRa Code:DRR037A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄出第1條cDNA鏈。反應(yīng)體系:5×Prime ScriptTMBuffer 4 μl，Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ1.0 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1.0 μl，Random 6 Primer(100 μmol/L)1.0 μl，Total RNA 10 μl(1000 ng)補(bǔ) RNase Free水至20 μl。37℃反應(yīng)15 min，85℃ 5 s，-20℃保存。引物設(shè)計(jì):根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在GenBank查詢所需要基因目的序列mRNA序列，引物均由寶生物 (大連)公司根據(jù)序列設(shè)計(jì)并合成。膠原Ⅰ:NM_053356，F(xiàn)orward 5'-TTCCCGGTGAATTCGGTCTC-3'，Reverse 5'-ACCTCGGATTCCAATAGGACCAG-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度107 bp;骨保護(hù)素 (osteoprotegerin，OPG):NM_057149.1，F(xiàn)orward 5'-GCAGCATCGCTCTGTTCCTGTA-3'，Reverse 5'-GCATGAGTCAGGTAGTGCTTCTGTG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度50 bp;GAPDH:NM_017008.3，F(xiàn)orward 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，Reverse 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度143 bp。

PCR檢測(cè):按照 Applied Biosystems公司7300儀器操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中PCR反應(yīng)體系20 μl，包括 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (2 ×)10 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl，Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl，ROX reference Dye or Dye Ⅱ(50 × )0.4 μl，cDNA 模板 (50 ng/μl)2 μl，補(bǔ)RNase Free水至20 μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;94℃變性5 s，退火31 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)數(shù)據(jù)分析處理采用△△Ct處理數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct表示數(shù)據(jù)的結(jié)果［5］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，首先用方差分析檢驗(yàn)各組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再用多參數(shù)t檢驗(yàn)驗(yàn)證各均數(shù)間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞接種培養(yǎng)至12 h左右貼壁，呈三角形、紡錘形或多角形等形態(tài);24 h后數(shù)量明顯增加，體積增大;3～5 d開始融合為單層，經(jīng)磁場(chǎng)暴露處理者呈特征性旋窩樣分布，對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)處理后10 d茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色鑒定，磁場(chǎng)處理組鈣化面積大于未經(jīng)磁場(chǎng)處理組的面積(圖2)。

成骨細(xì)胞增殖情況 SEMFs處理48 h和72 h后，0.5、1.0、1.5、2.0h組的成骨細(xì)胞增殖均受到明顯抑制 (P均＜0.05);SEMFs處理96 h后，0.5 h和1.0 h組成骨細(xì)胞增殖受到明顯抑制 (P均＜0.05)(圖3)。

ALP的活性和組織化學(xué)染色結(jié)果 SEMFs處理第9天，0.5 h和2.5 h組的ALP活性明顯高于對(duì)照組 (P均＜0.05);SEMFs處理第12天，0.5 h組的ALP活性明顯高于對(duì)照組 (P＜0.01)及其他SEMFs處理組 (P均 ＜0.05)(圖4)。0.5 h和1.0 h組ALP活性染色面積明顯大于對(duì)照組 (P＜0.01)，0.5 h組的ALP活性染色面積也明顯大于其他SEMFs處理組 (P均 ＜0.05)(圖5)。

圖2 成骨細(xì)胞形態(tài) (×100)Fig 2 The osteoblast morphology(×100)

圖3 成骨細(xì)胞增殖情況Fig 3 Proliferation of osteoblasts

圖4 各組ALP活性的比較Fig 4 Comparison of ALP activity among all groups

圖5 各組ALP活性染色面積的比較Fig 5 Comparison of ALP activity stained areas among all groups

鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果 SEMFs處理10 d后，0.5 h(P＜0.01)、1.0 h(P＜0.01)和1.5 h組 (P＜0.05)的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯多于對(duì)照組 (圖6)。

膠原Ⅰ和OPG mRNA表達(dá)情況 SEMFs處理大鼠成骨細(xì)胞48 h和96 h后，0.5 h(P＜0.01)和1.0 h組 (P＜0.05)膠原Ⅰ mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，處理96 h后0.5 h組的膠原Ⅰ mRNA表達(dá)水平明顯高于其他SEMFs處理組 (P均＜0.05)(圖7)。SEMFs處理成骨細(xì)胞96 h后，與對(duì)照組相比，0.5 h(P＜0.01)和1.0 h組 (P＜0.05)的OPG mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;SEMFs處理成骨細(xì)胞48 h后，0.5 h組的OPG mRNA表達(dá)水平也明顯高于對(duì)照組 (P＜0.05)(圖8)。

圖6 鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色Fig 6 Calcified tubercles after having been stained with alizarin red

圖7 各組成骨細(xì)胞膠原ⅠmRNA表達(dá)的比較Fig 7 Comparison of the collagenⅠmRNA expression of osteoblasts among all groups

圖8 各組成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)的比較Fig 8 Comparison of the OPG mRNA expression of osteoblasts among all groups

討 論

基于多年臨床數(shù)據(jù)的分析，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局證明電磁場(chǎng)治療是一種安全有效的治療骨不連接及骨質(zhì)疏松的方法［6-7］，電磁場(chǎng)可改變骨代謝活性，增加骨密度、改善骨的生化特性以及骨吸收等［8］;還可增加體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的形成、活性和存活［9］。有研究顯示，50 Hz 3.6 mT SEMFs可抑制成骨細(xì)胞增殖，也有文獻(xiàn)報(bào)道60 Hz 2 mT SEMFs可促進(jìn)RPMI 7666(B lymphoblast)增殖，但抑制T/G HA-VSMC［10］，因此磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞增殖的影響與細(xì)胞種類和磁場(chǎng)參數(shù)相關(guān)。

ALP活性是成骨細(xì)胞成熟分化活性的主要指標(biāo)，有文獻(xiàn)報(bào)道電磁場(chǎng)能提高血清中和體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞ALP活性［11-12］，本研究結(jié)果顯示，用50 Hz 3.6 mT SEMFs處理后，0.5 h組的ALP活性顯著增加。Liu等［13］報(bào)道，電磁場(chǎng)能增加骨質(zhì)疏松患者的骨密度和體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的鈣鹽沉積量，尤以0.5 h組鈣鹽沉積增加最為明顯。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平找到了50 Hz 3.6 mT SEMFs的一個(gè)時(shí)間效應(yīng)窗口即0.5 h。

Nagarajan等［14］研究發(fā)現(xiàn)，電磁場(chǎng)能促進(jìn)體外培養(yǎng)成細(xì)胞基因的表達(dá)。本研究分析了50 Hz 3.6 mT不同處理時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞膠原I和OPGmRNA的表達(dá)的影響，以期從分子水平證明不同處理時(shí)間電磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)間的效應(yīng)窗口。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEMFs能促進(jìn)OPG和膠原Ⅰ mRNA的表達(dá)水平，尤其是0.5h組的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和其他SEMFs處理組，從基因水平證明磁場(chǎng)與成骨細(xì)胞之間存在一定的時(shí)間效應(yīng)窗口。

綜上，本研究觀察了50 Hz 3.6 mT SEMFs不同處理時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電磁場(chǎng)與成骨細(xì)胞之間存在1個(gè)時(shí)間效應(yīng)窗口，即50 Hz 3.6 mT 0.5 h，因此推測(cè)電磁在治療骨質(zhì)疏松、骨折延遲愈合和骨不連接等相關(guān)骨病也可能存在1個(gè)時(shí)間效應(yīng)窗口，為電磁場(chǎng)治療骨病參數(shù)的選擇提供了一個(gè)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本研究結(jié)果也有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)。

［1］Huang LQ，He HC，Cheng Q，et al.Clinical update of pulsed electromagnetic fields on osteoporosis［J］.Chin Med J(Engl)，2008，121(20):2095-2099.

［2］賈雪，何成奇.脈沖電磁場(chǎng)治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展 ［J］.華西醫(yī)學(xué)，2009，24(1):247-249.

［3］Ivancsits S，Pilger A，Diem E，et al.Cell type-specific genotoxic effects of intermittent extremely low-frequency electromagnetic fields［J］.Mutat Res，2005，583(2):184-188.

［4］Zhou J，Ming LG，Chen KM，et al.Effects of 50 Hz sinusoidal electromagnetic fields of different intensities on proliferation，differentiation and mineralization potentials of rat osteoblasts［J］.Bone，2011，49(4):753-761

［5］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ctmethod［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［6］Richard HWF，Thomas M，Nurdan O.Electromagnetic effects-from cell biology to medicine ［J］.Pro His Cyt，2009，43(2):177-264.

［7］Chao EY，Inoue N，Koo TK，et al.Biomechanical considerations of fracture treatment and bone quality maintenance in elderly patients and patients with osteoporosis［J］.Clin Orthop Relat Res，2004，425(8):12-25.

［8］Luo E，Jiao L，Shen G，et al.Effects of the PEMFs of different intensity on BMD and biomechanical properties of rabbits’femur［J］.J Biomed Eng，2005，22(6):1168-1170.

［9］Chang K，Chang WH，Yu YH，et al.Pulsed electromagnetic field stimulation of bone marrow cells derived from ovariectomized rats affects osteoclast formation and local factor production［J］.Bioelectromagnetics，2004，25(2):134-141.

［10］Sul AR，Park SN，Suh H.Effects of sinusoidal electromagnetic field on structure and function of different kinds of cell lines［J］.Yonsei Med J，2006，47(6):852-861.

［11］Hartig M，Joos U，Wiesmann HP.Capacitively coupled electric fields accelerate proliferation of osteoblast-like primary cells and increase bone extracellular matrix formationin vitro［J］.Eur Biophys J，2000，29(7):499-506.

［12］Jiang YZ，Chen B.Short term effect of pulsed electromagnetic fields on management of osteoporosis［J］.Chin J Osteoporos，2005，11(1):365-367.

［13］Liu L，Dong LP，Li XX.Clinical analysis of pulsed electromagnetic fields on osteoporosis［J］.Chin J Rehabil Med，2008，121(20):2095-2099.

［14］Nagarajan S，Sukyee K，Anatoliy V，et al.Effects of BMP-2 and pulsed electromagnetic fields(PEMF)on rat primary osteoblastic cell proliferation and gene expression［J］.J Orthop Res，2007，26(14):1213-1220.

Effect of 3.6-mT Sinusoidal Electromagnetic Fields on Proliferation and Differentiation of Osteoblasts In Vitro

ZHOU Jian1，WANG Jia-qi1，GE Bao-feng1，MA Xiao-ni1，CHEN Ke-ming1，WEI Zhe2

1Institute of Orthopaedics，2Department of Medical Engineering，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA，Lanzhou 730050，China

CHEN Ke-ming Tel:0931-8994327，E-mail:chkeming@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigated the effect of 50-Hz 3.6-mT sinusoidal electromagnetic fields(SEMFs)on the proliferation and differentiation of osteoblastsin vitro.MethodsThe newborn rat calvarial osteoblasts were isolated by enzyme digestion and randomly divided into 6 groups after one passage.The treatment groups under 50-Hz 3.6-mT SEMFs and controls without SEMFs treatment.The cells were exposed in the SEMFs for 0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，and 2.5 h.They were observed under the contrast phase microscope each day.The calcified nodules were stained by alizarin red.The SEMFs were arranged in spiral appearance after 3 to 5 days.ResultsThe SEMFs showed characteristic distribution 3 to 5 days after SEMFs treatment.On the 9thday after treatment，the activity of alkaline phosphatase(ALP)significantly increased in the 0.5-h group，whereas the ALP histochemical straining results and the area of calcified nodules were consistent with ALP activity.In the 48-h and 96-h groups，the genetic expression levels of osteoprotegerin and collagen-Ⅰwere significantly higher than that in the control group;particularly，the mRNA expression increased in the 0.5-h group.ConclusionThe SEMFs at 50-Hz 3.6-mT could suppress the p roliferation of osteoblastsmaturation but stimulate the differentiation and maturation of osteoblastsin vitro.

osteoblasts;sinusoidal electromagnetic fields;collagen-Ⅰ;osteoprotegerin

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):353-358

陳克明 電話:0931-8994327，電子郵件:chkeming@yahoo.com.cn

R318

A

1000-503X(2012)04-0353-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.008

甘肅省科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目 (09ZNKDA025)Supported by the Grant from Gansu Provincial Science and Technology Department(09ZNKDA025)

2011-07-19)

·論 著·