腺病毒介導(dǎo)的堿性成纖維細胞生長因子對大鼠脊髓損傷腹后外側(cè)索少突膠質(zhì)細胞的影響

楊彥玲

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，陜西延安 716000

腺病毒介導(dǎo)的堿性成纖維細胞生長因子對大鼠脊髓損傷腹后外側(cè)索少突膠質(zhì)細胞的影響

楊彥玲

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，陜西延安 716000

目的觀察腺病毒 (Adts)介導(dǎo)堿性成纖維細胞生長因子 (FGF-2)對大鼠脊髓損傷腹后外側(cè)索少突膠質(zhì)細胞的影響。方法32只SD大鼠在T10水平制備脊髓損傷模型，隨機分為體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療組和損傷對照組，用攜帶FGF-2和綠色熒光蛋白 (GFP)的Adts行直接體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療。熒光顯微鏡觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達，斜板實驗檢測大鼠運動功能恢復(fù)情況，免疫組織化學(xué)染色觀察腹后外側(cè)索少突膠質(zhì)細胞 (CC1+)數(shù)量的變化。結(jié)果熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Adts載體直接引入脊髓后可有效感染脊髓組織并表達報告基因。斜板實驗檢測結(jié)果顯示，體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療組大鼠的傾斜平面角度明顯高于對照組 (P＜0.05或P＜0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果證實，腹后外側(cè)索CC1+數(shù)量較對照組明顯增加 (P＜0.05)。結(jié)論Adts介導(dǎo)的FGF-2可促進少突膠質(zhì)細胞的存活和增殖。

脊髓損傷;堿性成纖維細胞生長因子;少突膠質(zhì)細胞;腺病毒載體;基因治療

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重創(chuàng)傷，因其高致殘率和高病死率一直成為醫(yī)學(xué)研究的熱門課題。堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-2)對細胞有強烈的促進增殖和有絲分裂作用，對脊髓損傷的再生和修復(fù)具有重要作用，并且在脊髓損傷早期所起作用更為顯著［1-3］。針對FGF-2在脊髓損傷后對神經(jīng)元保護的可能機制，學(xué)術(shù)界提出了不同觀點，如:FGF-2穩(wěn)定細胞鈣離子水平，抑制脊髓損傷區(qū)細胞凋亡，抑制c-fos基因的表達，抑制一氧化氮 (NO)的毒性，降低自由基形成，對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的反應(yīng)等［4-6］。近年來，一些學(xué)者強調(diào)了少突膠質(zhì)細胞 (CC1+)在脊髓損傷后的作用［6-7］。FGF-2可能參與了脊髓損傷后CC1+存活的調(diào)節(jié)，但是FGF-2如何調(diào)控損傷脊髓內(nèi)CC1+的存活、分化和增殖，以及CC1+數(shù)量增加和運動功能的恢復(fù)是否有關(guān)，這些問題有必要進行深入研究。本研究通過腺病毒 (adenoviruses，Adts)介導(dǎo)將FGF-2基因轉(zhuǎn)染至脊髓損傷局部，觀察了FGF-2基因在體內(nèi)的表達及對脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其可能機制。

材料和方法

實驗分組 雌性成年SD大鼠32只，體重200～220 g，隨機分為4組 (n=8):(1)FGF-2-Adts高滴度組 (1.27×107pfu/rat);(2)FGF-2-Adts中等滴度組 (6.37×106pfu/rat);(3)FGF-2-Adts低滴度組(3.18×106pfu/rat);(4)綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)-Adts組 (5.9×107pfu/rat)。所用載體是攜帶小鼠FGF-2 cDNA表達片段的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，由Doc.Smith(美國肯塔基州大學(xué))惠贈。大鼠術(shù)后死亡2只，隨后補充。分籠飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，室溫25℃。

脊髓損傷模型的制備 SD大鼠用80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg賽拉嗪進行腹腔麻醉，角膜上涂人工眼淚以保持眼睛濕潤，防止角膜干燥。大鼠取俯臥位，背部剃毛備皮，酒精碘酒消毒，鋪一次性無菌單。以T10棘突為中心作長約3 cm切口暴露硬脊膜。用美國PSI公司生產(chǎn)的脊髓打擊器制備脊髓急性打擊傷動物模型，以損傷力度200 kdynes/cm2(2×10-3N)造成大鼠脊髓不完全損傷，致傷后迅速移開打擊物。模型成功的判定標準:打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。

腺病毒載體轉(zhuǎn)染脊髓方法 損傷完成后迅速利用納升微量注射器和微電極推進器在損傷部位尾端左側(cè)和右側(cè)注射不同滴度的FGF-2-Adts和GFP-Adts。微注射器插入脊髓組織0.6 mm，每次注射50 nl，共10次，注射完后，讓毛細玻璃管在組織中繼續(xù)停留2 min，使病毒均勻擴散開來。左側(cè)完成后，以同樣方法進行右側(cè)，共注射1 μl病毒。用無菌生理鹽水沖洗傷口后，以可吸收腸線縫合肌層，傷口夾子鉗夾皮層。術(shù)后護理包括皮下注射33.3 mg/kg頭孢唑啉注射液和20 ml Ringer's液，每天2次，持續(xù)3～5 d。每日膀胱按摩2次至大鼠自主排尿反射建立。電熱毯加熱，分籠飼養(yǎng)，自由取食，每天更換1次墊料保持干燥。2周后以乙醚麻醉大鼠，去掉傷口夾子。

取材 采取心臟灌注固定法，在戊巴比妥鈉150 mg/kg深度麻醉下開胸，經(jīng)左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，先用4℃ 0.1 mol/L的PBS液快速灌注5 min。再以4℃ 4%多聚甲醛溶液灌注約200 ml，持續(xù)15 min。灌注完畢立即再次打開脊髓，取脊髓組織3 cm(以損傷為中心上下各1.5 cm)，多聚甲醛溶液固定4～6 h。0.2 mol/L PBS過夜，20%蔗糖溶液固定24～48 h，包埋，做連續(xù)冰凍切片，片厚約20 μm，-20℃冷凍備用。

運動功能評估 采用改良 Rivlin方法［8］，即在一長方形木制板上墊2 mm的橡膠墊，板可繞下邊旋轉(zhuǎn)。將大鼠頭向前，身體縱軸與斜面板縱軸垂直放置，逐漸增大木板與水平面間的角度，直至大鼠在原定位置上剛好可以維持5 s，這一角度即為傾斜平面臨界角度。在大鼠傷后1、4 d及1、2、3、4周分別測定傾斜平面臨界角度。每只動物測5次，取其平均值作為測定值。

免疫組織化學(xué)染色 在常溫下用含3%山羊血清、0.3%triton-X(TTX)和1%BSA的0.1 mol/L PBS孵育1 h后，加CC1+APC單克隆抗體 (Ab-7;Calbiochem，EMD Biosciences，San Diego，CA，10 g/ml)，4℃過夜。第2天以0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次后，加入1∶200稀釋的山羊抗兔抗體，4℃過夜。第3天0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次后，加入1∶300稀釋的鏈親合素異硫氰酸熒光素 (streptavidin-FITC)，3 h避光，0.1 mol/L PBS洗片10 min×3次，蓋玻片封膠。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用StatView 4.5.3統(tǒng)計軟件包，計量資料用F檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果 倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，注射局部灰質(zhì)和白質(zhì)的膠質(zhì)細胞內(nèi)均有GFP表達，在病毒注射部位及臨近的部位，尤其在距離注射部位3～4 mm范圍內(nèi)有較多的體內(nèi)細胞表達GFP，距離注射部位越遠，表達GFP的細胞越少，但在距離注射部位7～8 mm的脊髓內(nèi)仍可見表達GFP的細胞(圖1)。

圖1 脊髓損傷后GFP表達的分布情況 (×100)Fig 1 Distribution of GFP-Adts expression after spinal cord injury(×100)

斜板實驗檢測結(jié)果 脊髓損傷1 d，各組動物的臨界角度降至最低點，約為25°;傷后4 d內(nèi)，治療組和對照組的傾斜平面臨界角度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);傷后1周，F(xiàn)GF-2組大鼠的傾斜平面臨界角度值較GFP對照組上升更為明顯，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);傷后2～4周，各組大鼠的臨界角度均有部分回升，但FGF-2治療組較GFP對照組回升的幅度更大 (P＜0.01)(表1)。

腹后外側(cè)索CC1+的數(shù)量變化 熒光顯微鏡下可見CC1+細胞核為免疫陽性染色，呈藍色，F(xiàn)GF-2組CC1+大量增殖，細胞密度明顯增大 (圖2)。三維細胞計數(shù)腹后外側(cè)索CC1+顯示，F(xiàn)GF-2高、中、低滴度組的 CC1+數(shù)量分別為 (648 000±30 000)、(752 000±32 000)、(644 000±28 000)個，均明顯高于GFP對照組的 (532 000±26 000)個 (P均＜0.05)，中滴度組的CC1+數(shù)量與低滴度組、高滴度組相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＜0.05)。

表1 脊髓損傷后大鼠傾斜平面臨界角度變化 (n=8，± s，°)Table 1 Changes of the maximal angles of inclined plane after severe spinal cord injury(n=8，± s，°)

表1 脊髓損傷后大鼠傾斜平面臨界角度變化 (n=8，± s，°)Table 1 Changes of the maximal angles of inclined plane after severe spinal cord injury(n=8，± s，°)

與GFP對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP＜0.05，bP ＜0.01 compared with GFP control group

分組Group Days after injury 1 d 4 d 1周1 week 2周2 weeks 3周3 weeks 4周損傷后的時間4 weeks綠色熒光蛋白組GFP group低滴度FGF-2組FGF-2-low中滴度FGF-2組FGF-2-medium高滴度FGF-2組FGF-2-high 25.1±2.6 26.6±2.6 25.6±2.7 27.6±2.4 26.4±2.6 28.4±2.2 27.4±2.4 29.4±2.7 29.4±3.4 38.4±3.2a 39.4±3.6a 43.4±3.5a 35.4±3.2 45.4±3.2b 46.4±3.7b 48.4±3.8b 39.4±3.5 48.4±3.2b 49.4±3.6b 52.4±3.5b 42.4±3.6 50.4±3.4b 51.4±3.8b 54.4±3.9b

圖2 腹后外側(cè)索的少突膠質(zhì)細胞的表達Fig 2 Over-expression of oligodendrocytes in the ventral lateral funiculi

討 論

FGF-2是一種對神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、分化及再生起重要調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，對細胞有強烈的促進增殖和有絲分裂作用［2］。Rabchevsky等［9］選用蛛網(wǎng)膜下腔置管、微量泵連續(xù)l周給予外源性FGF-2的干預(yù)方法研究脊髓損傷大鼠，通過6周的觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠運動功能有明顯恢復(fù)，說明外源性FGF-2對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)有確切作用。Meijs等［10］在行雪旺氏細胞移植治療胸髓橫斷傷時發(fā)現(xiàn)，給予外源性FGF-2者損傷周圍軸突的再生情況比未給予外源性FGF-2者明顯要好，說明外源性FGF-2可促進脊髓損傷后軸突的再生。這些研究表明FGF-2可以保護脊髓神經(jīng)組織、促進神經(jīng)纖維再生。

由于脊髓損傷需長時間提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過局部或全身給予外源性FGF-2均難以達到理想的治療效果，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展使其發(fā)揮長期、高效的作用成為可能。Adts載體具有宿主范圍廣、增殖和非增殖細胞都能夠轉(zhuǎn)染和表達、病毒基因組不整合入宿主染色體內(nèi)、病毒滴度高、外源基因表達水平高、插入容量大等優(yōu)點，是一種理想的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療載體。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)把FGF-2基因移植到動物體內(nèi)以足量分泌FGF-2因子，改善脊髓損傷微環(huán)境，對神經(jīng)元起支持和保護作用。

直接將載體引入靶組織的注射法是一種切實可靠的簡便方法。Zhang等［11］采用的注射劑量約為0.5 μl，本研究的劑量稍大，結(jié)果證明單純注射本身引起的創(chuàng)傷對下肢功能沒有明顯損害。后期的觀察未發(fā)現(xiàn)功能障礙，表明重組腺病毒所引起的局部反應(yīng)也未造成功能損害。作為轉(zhuǎn)基因治療脊髓損傷的初步研究，本研究利用復(fù)制缺陷腺病毒載體將外源性FGF-2基因直接引入脊髓，證實該載體可有效地感染脊髓組織和表達報告基因。

本實驗室的前期工作已經(jīng)表明，將FGF-2基因直接轉(zhuǎn)染至損傷部位，治療組脊髓損傷組織的體積明顯減小而脊髓灰質(zhì)殘存組織的體積明顯增加，與對照組相比有顯著差別，說明FGF-2能減少脊髓損傷后的壞死和萎縮，由此說明Adts介導(dǎo)FGF-2體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療創(chuàng)傷性脊髓損傷的方法是可行的，且由Adts介導(dǎo)FGF-2的直接體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療能夠明顯促進損傷脊髓的功能恢復(fù)［12］。本研究結(jié)果顯示，將FGF-2基因直接轉(zhuǎn)染至損傷部位，發(fā)現(xiàn)1～4周脊髓損傷大鼠的后肢運動功能評分較GFP對照組明顯增高，腹后外側(cè)索CC1+數(shù)量明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示FGF-2能夠明顯改善大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復(fù)，運動功能的恢復(fù)與提高腹后外側(cè)索CC1+的數(shù)量有關(guān)。由Adts介導(dǎo)FGF-2的直接體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療能夠明顯促進脊髓損傷的功能恢復(fù)，其原因可能是:促進少突膠質(zhì)前體細胞和少突膠質(zhì)細胞的存活和增殖，改善損傷脊髓軸突髓鞘化;同時調(diào)節(jié)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞之間的相互作用從而促進中樞神經(jīng)內(nèi)軸突的再生，促進脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。

(志謝:感謝美國肯塔基州大學(xué)腦脊髓損傷中心Alexander Rabchevsky教授對本工作的指導(dǎo))

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Effect of Adenovirus-mediated Basic Fibroblast Growth Factor Gene Transfer in vivo on Oligodendrocyte Cell Numbers Throughout Ventrolateral White Matter Following Spinal Cord Injury in Rats

YANG Yan-ling

Department of Physiology，Medical College of Yan'an University，Yan'an，Shaanxi 716000，China

YANG Yan-ling Tel:0911-2418889，E-mail:yangyanling8889@163.com

ObjectiveTo study the effect of adenovirus-mediated basic fibroblast growth factor(FGF-2)gene transferin vivoon oligodendrocyte cell numbers throughout ventrolateral white matter following spinal cord injury in rats.MethodsThirty-two adult female Sprague Dawley rats were injured with the Infinite Horizon Impactor，and then were randomly assigned to four groups:FGF-2-Adts high-titer group(1.27 ×107pfu/rat)，F(xiàn)GF-2-Adts intermediate-titre group(6.37×106pfu/rat)，F(xiàn)GF-2-Adts low-titer group(3.18×106pfu/rat)，and green fluorescent protein(GFP)-Adts group(5.9×107pfu/rat).The transgenic expressionin vivowas detected with fluorescence microscopy.The locomotor function of the hindlimbs of rats was evaluated using Rivlin plate.Slides mounted with tissue sections were processed for immunohistochemical detection and quantification of oligodendrocytes(CC1+)in the ventral lateral funiculi(VLF)of injured spinal cords.ResultsOne week after spinal cord injury，GFP showed that many cells had expressed objective genein vivoand the anglesof the occlusal plane of rats in FGF-2 groups were significantly higher than in GFP-Adts group.Also，there was a significant difference among the FGF-2-Adts treatment groups for the volume of gray matter sparing.However，there were no significant differences for total white matter sparing.Stereological quantification of total CC1+cell numbers in the spared VLF showed a significant reduction in numbers with GFP controls compared to all other groups 4 weeks after injury.In contrast，the FGF-2 Adts intermediate-titer group had significantly more CC1+cells when compared to both the FGF-2-Adts high-and low-titer groups.ConclusionAdenovirus-mediated FGF-2 gene transfer can promote the functional recovery of the injured spinal cord by enhancing the proliferation and/or differentiation of oligodendrocytes.

spinal cord injury;basic fibroblast growth factor;oligodendrocyte cell;adenoviruses vector;gene therapy

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):348-352

楊彥玲 電話:0911-2418889，電子郵件:yangyanling8889@163.com

R744

A

1000-503X(2012)04-0348-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.007

陜西省教育廳科學(xué)研究項目計劃 (12JK0705)Supported by the Scientific Research Program for the Education Department in Shaanxi Province(12JK0705)

2012-04-11)

·論 著·