唑來膦酸預(yù)防股骨頭壞死塌陷的效果及機(jī)制

范 猛，姜文學(xué)，汪愛媛，王 玉，彭 江，張 莉，許文靜，盧世璧

1天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津 300192 2中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京 100853

唑來膦酸預(yù)防股骨頭壞死塌陷的效果及機(jī)制

范 猛1，2，姜文學(xué)1，汪愛媛2，王 玉2，彭 江2，張 莉2，許文靜2，盧世璧2

1天津市第一中心醫(yī)院骨科，天津 3001922中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京 100853

目的觀察唑來膦酸預(yù)防股骨頭壞死塌陷的效果及作用機(jī)制。方法將24只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、安慰劑組和治療組3組，每組8只。假手術(shù)組為陽性對照組，安慰劑組在建立股骨頭壞死模型后給予生理鹽水治療，治療組在建立股骨頭壞死模型后給予唑來膦酸治療。術(shù)后5周處死大鼠，取術(shù)側(cè)股骨分別行X線、Micro-CT和組織學(xué)檢查。結(jié)果股骨頭高度與寬度的比值安慰劑組＜治療組＜假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.01)。治療組和假手術(shù)組的股骨頭體積、股骨頭內(nèi)骨量和骨礦鹽含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)，但都明顯大于安慰劑組 (P均＜0.01)。組織學(xué)檢查顯示，治療組股骨頭內(nèi)以死骨為主，破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及血管新生的數(shù)量均低于安慰劑組。結(jié)論唑來膦酸可抑制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活動及血管新生，保存骨量和股骨頭形態(tài)，具有良好的預(yù)防股骨頭壞死塌陷的作用。

骨壞死;塌陷;唑來膦酸;破骨細(xì)胞;成骨細(xì)胞

股骨頭壞死是骨科常見疾患，可造成髖關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，通常會進(jìn)展為股骨頭的塌陷而需要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換治療。如何預(yù)防股骨頭壞死進(jìn)展到塌陷一直是骨科研究的重點(diǎn)，國外已有報道二磷酸鹽類藥物在股骨頭壞死的治療中具有緩解疼痛及延緩塌陷的作用，但尚缺乏其在骨壞死治療過程中的機(jī)制研究。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)觀察了二磷酸鹽類藥物在骨壞死治療中對于破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及血管新生的影響，探討了其在骨壞死治療中的作用機(jī)制。

材料和方法

材料 雄性SD大鼠24只，體重 (398±24.6)g，由中國人民解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，按照SPF級別標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，自由飲食。使用儀器為美國GE eXplore Locus小動物活體Micro-CT，最大分辨率27 μm，圖像后處理軟件為GE公司提供的GE Micro View。唑來膦酸由瑞士諾華制藥有限公司提供。

動物模型的建立 將24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組 (n=8)和動物模型組 (n=16)2組。動物模型組參照Peled等［1］報道的方式建立骨壞死動物模型，具體為:10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，脫毛、備皮后消毒，鋪無菌巾單，以大轉(zhuǎn)子為中心取右髖部外側(cè)切口，長約3 cm，鈍性沿肌纖維方向分離臀大肌，牽開肌肉，切開髖關(guān)節(jié)囊顯露股骨頭，將髖關(guān)節(jié)脫位，切斷圓韌帶，鈍性剝離股骨頸近端骨膜組織，將髖關(guān)節(jié)復(fù)位，保護(hù)坐骨神經(jīng)并保持髖關(guān)節(jié)深層肌肉完整以避免術(shù)后髖關(guān)節(jié)脫位，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，分層關(guān)閉傷口。假手術(shù)組與動物模型組采用相同麻醉及皮膚切口，在切開皮膚后鈍性分離臀大肌后，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，分層關(guān)閉傷口。大鼠術(shù)后麻醉蘇醒后均正常飲食及活動。

術(shù)后處理 術(shù)后1周，將動物模型組隨機(jī)分成治療組和安慰劑組2組，每組8只。治療組將唑來膦酸溶于生理鹽水 (1 mg溶于4 ml生理鹽水)，按照0.4 ml/kg劑量即0.1 mg/kg給予單次皮下注射。安慰劑組及假手術(shù)組給予生理鹽水0.4 ml/kg單次皮下注射，大鼠繼續(xù)正常飲食及活動。術(shù)后5周，給予過量苯巴比妥鈉肌肉注射處死，分別取出各組實(shí)驗(yàn)動物右側(cè)股骨標(biāo)本，以4%多聚甲醛溶液固定2周。

X線檢測 行股骨標(biāo)本前后位X線檢查，曝光條件為32 kV、10 ms，放大比率×1。測量圖像，分別測量股骨頭的高度及寬度，計(jì)算股骨頭高度及寬度的比值 (H/L)［2］。

Micro-CT掃描 將股骨標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，掃描分辨率為27 μm，對Micro-CT掃描的結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)體模校準(zhǔn)后，手動選取股骨頭區(qū)域進(jìn)行計(jì)算。分別計(jì)算:股骨頭總體積 (total volume，TV)、骨組織體積(bone volume，BV)、骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume fraction，BVF;BVF=BV/TV)、骨礦密度 (bone mineral density，BMD)、骨 小 梁 厚 度 (trabecula thickness，TbTh)和骨小梁間隙 (trabecula space，TbSp)寬度。

組織學(xué)檢查 經(jīng)乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣后將股骨頭冠狀位切5 μm薄片，行組織學(xué)檢查。分別行常規(guī)HE染色、抗酒石酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色，骨橋蛋白 (osteopontin，OPN)、血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫組織化學(xué)染色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間及組內(nèi)差異比較采用單因素ANOVA分析，此后的組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)方差齊性采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

大體觀察 各組動物在實(shí)驗(yàn)過程中均無死亡及傷口感染表現(xiàn)，患肢術(shù)后1周均可負(fù)重。處死大鼠取標(biāo)本時各組股骨頭均未見明顯脫位，關(guān)節(jié)面未見明顯骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。治療組及安慰劑組均可見股骨頭輕度變扁，以安慰劑組較為明顯。股骨頭冠狀位切面見治療組及安慰劑組存在骨吸收表現(xiàn) (圖1)。

圖1 各組股骨頭冠狀剖面圖，可見治療組及安慰劑組存在股骨頭骨吸收，安慰劑組股骨頭骨質(zhì)高度明顯減低Fig 1 Coronal images of femoral head bone，absorption could be seen at treatment group and placebo group，the height of femoral head of placebo group decreased significantly

X-ray表現(xiàn) 假手術(shù)組股骨頭頸形態(tài)良好，治療組股骨頭輕度變扁、股骨頸變細(xì)，安慰劑組股骨頭明顯變扁、股骨頸細(xì)小 (圖2)。治療組股骨頭高度與寬度的比值明顯高于安慰劑組，低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.01)(圖3)。

圖2 各組股骨標(biāo)本X線前后位片F(xiàn)ig 2 Antero-posterior X-ray images of proximal femur

Micro-CT表現(xiàn) 安慰劑組股骨頭變形明顯，股骨頭變小變扁;與假手術(shù)組相比，治療組股骨頭形態(tài)也有輕度變小變扁，但好于安慰劑組 (圖4)。治療組和假手術(shù)組的TV、BV和股骨頭骨礦鹽含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)，但都明顯大于安慰劑組 (P均＜0.01);3組的 BMD、TbTh和TbSp差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＞0.05)(圖5)。

圖3 各組股骨頭高度與長度比值的比較Fig 3 Comparison of the height and length ratio of femoral head among all groups

圖4 各組標(biāo)本的Micro-CT冠狀位斷層圖像Fig 4 Coronal slice Micro-CT images of proximal femur

圖5 各組股骨頭體積、骨組織體積、骨礦鹽含量、骨礦密度、骨小梁厚度和骨小梁間隙的比較Fig 5 Comparison of totol volume，bone volume，tissue mineralized content，bone mineral density，trabecular thickness，and trabecular space among all groups

組織學(xué)檢查

HE染色:可見治療組和安慰劑組股骨頭高度變低，骨小梁較假手術(shù)組稀疏，且廣泛存在以空骨陷窩為標(biāo)志的壞死骨 (圖6)。

TRAP染色:假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)股骨頭內(nèi)有明顯的破骨細(xì)胞 (TRAP染色陽性靠近骨表面有3個核以上的細(xì)胞)，股骨頭內(nèi)未發(fā)現(xiàn)死骨存在;安慰劑組股骨頭內(nèi)可見散在的破骨細(xì)胞;治療組可見股骨頭內(nèi)骨小梁有很少量破骨細(xì)胞，數(shù)量較安慰劑組少 (圖7)。

OPN染色:假手術(shù)組均為活骨，在軟骨細(xì)胞與骨細(xì)胞交界區(qū)域可見較多成骨細(xì)胞存在;安慰劑組可見死骨與活骨散在分布，在死骨與活骨交界區(qū)域可見少量成骨細(xì)胞存在;治療組的骨小梁以死骨為主，在活骨與死骨交界部位可見很少量成骨細(xì)胞 (圖8)。

VEGF染色:假手術(shù)組均為活骨，未見明顯VEGF陽性表現(xiàn);安慰劑組在死骨與活骨交替區(qū)域，即修復(fù)界面存在較多的VEGF陽性表現(xiàn);治療組以死骨為主，即便在修復(fù)界面也未見明顯VEGF陽性表現(xiàn) (圖9)。

圖6 股骨頭HE染色結(jié)果Fig 6 HE stained coronal slice images of femoral head

圖7 股骨頭標(biāo)本TRAP染色 (×200)Fig 7 TRAP staining of femoral head(×200)

圖8 股骨頭標(biāo)本OPN染色 (×200)Fig 8 OPN staining of femoral head(×200)

圖9 股骨頭標(biāo)本VEGF染色 (×400)Fig 9 VEGF staining of femoral head(×400)

討 論

本研究通過手術(shù)破壞股骨頭及頸部的血運(yùn)，成功建立了創(chuàng)傷性骨壞死動物模型，在安慰劑組，可見股骨頭內(nèi)廣泛存在空骨陷窩及伴隨的修復(fù)反應(yīng)，死骨與活骨修復(fù)界面及骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。Micro-CT檢查可見股骨頭形態(tài)變扁，股骨頭體積減小，骨礦物量減小，存在明顯的骨吸收現(xiàn)象。通過TRAP、OPN和VEGF免疫組織化學(xué)染色可以發(fā)現(xiàn)，股骨頭內(nèi)存在破骨細(xì)胞活動、血管新生活躍及成骨細(xì)胞活動，顯示存在骨修復(fù)反應(yīng)，故本模型是成功的股骨頭骨壞死創(chuàng)傷性動物模型。與假手術(shù)組相比，安慰劑組可以發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞明顯活躍，但成骨細(xì)胞活動并沒有顯著增加，從而造成了成骨活動落后于破骨活動，股骨頭形態(tài)表現(xiàn)出明顯的吸收表現(xiàn)，筆者認(rèn)為這正是股骨頭出現(xiàn)形態(tài)改變的原因。

骨修復(fù)過程中存在成骨活動和破骨活動的平衡［3-4］，一方面成骨細(xì)胞活動產(chǎn)生新骨，另一方面破骨細(xì)胞活動清除死骨，而正是成骨和破骨活動的失衡才造成了修復(fù)過程的力學(xué)輕度減低，產(chǎn)生股骨頭的塌陷。Li等［4］觀察到在骨壞死修復(fù)過程中破骨細(xì)胞活動增強(qiáng)，Weinstein等［5］發(fā)現(xiàn)在激素相關(guān)性骨壞死中出現(xiàn)破骨細(xì)胞的生存周期延長，這些可能正與成骨活動和破骨活動的失衡有關(guān)。二磷酸鹽是破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收的有效抑制劑，可以抑制HMG-COA還原通路的尼脂焦磷酸化酶，從而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，并加速破骨細(xì)胞凋亡。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)［6-10］和臨床研究［11-13］證實(shí)，通過使用二磷酸鹽抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收對于股骨頭壞死具有保護(hù)作用。但本研究結(jié)果顯示，唑來膦酸的作用不僅是抑制破骨細(xì)胞活動，結(jié)合TRAP染色發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸具有很強(qiáng)的抑制破骨細(xì)胞活動的能力，在股骨頭內(nèi)存在大片壞死骨，但即便在血運(yùn)良好的修復(fù)界面，也僅有很少TRAP存在;而VEGF染色發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸抑制骨修復(fù)反應(yīng)的作用不僅是通過抑制破骨細(xì)胞的活性，血管新生也受到明顯抑制，在血管新生受限的情況下則必然破骨活動和成骨活動都會受到影響，造成修復(fù)反應(yīng)遲滯。在治療組，通過抑制破骨細(xì)胞活動及新生血管形成而影響了死骨修復(fù)過程，與安慰劑組股骨頭內(nèi)大量活骨存在相比，治療組股骨頭內(nèi)仍以死骨表現(xiàn)為主，僅存在有限的修復(fù)反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在使用唑來膦酸進(jìn)行治療后，血管新生及成骨細(xì)胞活性同樣受到抑制，從而滯后了修復(fù)反應(yīng)并降低了修復(fù)反應(yīng)的強(qiáng)度。

已經(jīng)有多項(xiàng)研究報道二磷酸鹽類治療股骨頭壞死的不足，主要表現(xiàn)為:(1)半衰期長，長期全身用藥會干擾骨正常生長［8］，故不適于用于兒童;(2)必須通過血運(yùn)重建到達(dá)作用部位，骨壞死因血運(yùn)受損而影響其作用［14］;(3)可出現(xiàn)下頜骨骨壞死［15］。本研究通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，由于二磷酸鹽對于修復(fù)反應(yīng)的抑制造成其治療后股骨頭內(nèi)死骨長期維持在無活力狀態(tài)，雖然保存了股骨頭的外形，但不是預(yù)期的恢復(fù)為具有良好排列和活力的健康狀態(tài)，若要維持治療效果必須長期用藥，而且由于用藥后表現(xiàn)為破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和血管新生的全面抑制，所以其是降低了修復(fù)反應(yīng)的強(qiáng)度，但并沒有糾正修復(fù)反應(yīng)中成骨滯后于破骨的失衡狀態(tài)。使用二磷酸鹽類進(jìn)行股骨頭壞死的治療，只是延長病程，拖延出現(xiàn)股骨頭塌陷的時間，并不會改變股骨頭壞死的結(jié)局，經(jīng)治療后仍會出現(xiàn)股骨頭的緩慢變形，甚至逐漸進(jìn)展至塌陷。在本研究中，不但Micro-CT和組織學(xué)形態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)治療組仍存在股骨頭輕度變形，在股骨頭形態(tài)高度/長度比的比較中，治療組好于安慰劑組但差于假手術(shù)組也證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，唑來膦酸可通過抑制破骨細(xì)胞和血管新生，抑制修復(fù)反應(yīng)，從而延緩股骨頭塌陷，具有一定程度預(yù)防股骨頭壞死塌陷的作用，但并不能糾正骨壞死修復(fù)過程中成骨與破骨過程的不平衡。

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Effect and Mechanism of Zoledronate on Prevention of Collapse in Osteonecrosis of the Femoral Head

FAN Meng1，2，JIANG Wen-xue1，WANG Ai-yuan2，WANG Yu2，PENG Jiang2，ZHANG Li2，XU Wen-jing2，LU Shi-bi2

1Department of Orthopeadics，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China
2Institute of Orthopeadics，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

PENG Jiang Tel:010-66939202，E-mail:shibilu301@gmail.com

ObjectiveTo observe the effect and mechanism of zoledronate on prevention of collapse in an animal model of osteonecrosis.MethodsIschemic osteonecrosis was surgically induced in 16 SD rats(which were further divided into zoledronate group and placebo group);another 8 rats were used as sham surgery group(n=8).The animals were killed 5 weeks after surgery.Radiographic，Micro-CT，histological，and immunohistochemical assessments were performed.ResultsRadiographic assessment showed better preservation of the femoral head shape in the zoledronate group than in the placebo group but not significantly different from the sham surgery group.Micro-CT assessment showed higher totol volume，bone volume，and total mineralized content in the zoledronate group(allP＜0.01)than in the placebo group but not significantly different from that in the sham surgery group(allP＞0.05).Compared with the placebo group，the zoledronategroup had reduced osteoclast and osteoblast activity，as confirmed by histological examinations.ConclusionZoledronate can decrease the femoral head deformity by reducing the osteoclast activity while suppressing new bone and vessels formation in a rat model of traumatic osteonecrosis，and therefore may delay the collapse of femoral head.

osteonecrosis;collapse;zoledronate;osteoclast;osteoblast

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):330-336

彭 江 電話:010-66939202，電子郵件:shibilu301@gmail.com

R681.8

A

1000-503X(2012)04-0330-07

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.004

國家自然科學(xué)基金 (30930092、30872621)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30930092，30872621)

2011-12-07)

·論 著·