靶向敲減Ras癌蛋白融合型泛素連接酶E3的構(gòu)建

馬怡暉，張 強(qiáng)，谷雨妹，盧朝輝，陳 杰

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京 100730 2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，鄭州 450052

靶向敲減Ras癌蛋白融合型泛素連接酶E3的構(gòu)建

馬怡暉1，2，張 強(qiáng)1，谷雨妹1，盧朝輝1，陳 杰1

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院病理科，北京 1007302鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，鄭州 450052

目的應(yīng)用蛋白質(zhì)敲減技術(shù)原理，構(gòu)建理論上能夠靶向敲減Ras癌蛋白的融合型泛素連接酶E3的真核表達(dá)載體。方法選取Raf-1、PI3K、RalGDS中能夠與Ras蛋白相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和具有泛素連接酶活性的F-Box及U-Box作為功能結(jié)構(gòu)域，采用分子克隆技術(shù)依次將其連入pcDNA3.1中構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，雙酶切、PCR和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)連入核苷酸片段的正確性，Western blot檢測(cè)融合蛋白表達(dá)載體在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的正確性和作用有效性。結(jié)果

成功獲得6個(gè)融合蛋白E3表達(dá)載體，5個(gè)能夠在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)，其中 (RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1能夠敲減人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞中Ras蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建能夠靶向敲減Ras癌蛋白的融合蛋白表達(dá)載體，為下一步應(yīng)用蛋白質(zhì)敲減技術(shù)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

泛素;蛋白酶體;泛素連接酶;Ras癌蛋白

泛素-蛋白酶體途徑 (ubiquitin-proteasome pathway，UPP)主要由泛素分子、泛素激活酶E1、泛素轉(zhuǎn)移酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體構(gòu)成，其中E3負(fù)責(zé)蛋白底物同UPP途徑的聯(lián)系，是決定UPP特異性降解蛋白底物的關(guān)鍵酶［1］。靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù) (又名蛋白質(zhì)敲減技術(shù))是利用UPP原理，構(gòu)建某個(gè)能與靶蛋白特異結(jié)合的融合型泛素連接酶E3，達(dá)到降解靶蛋白的目的［2-3］。本研究利用該技術(shù)，以Ras癌蛋白作為靶向泛素化降解的對(duì)象，構(gòu)建了能夠靶向敲減Ras癌蛋白的融合型泛素連接酶的表達(dá)載體，以期在蛋白水平上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)對(duì)Ras的降解。

材料和方法

試劑和儀器 基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (北京天根生物有限公司)，DNA聚合酶、dNTP、各種核酸內(nèi)切酶、T4連接酶 (日本Takara公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑、高溶點(diǎn)瓊脂糖 (美國(guó)Invitrogen公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人Ras單克隆抗體和c-Myc標(biāo)簽單克隆抗體 (美國(guó)Santa cruz公司)，HPR標(biāo)記二抗 (北京中山金橋生物有限公司)，丙烯酰胺、N'N'-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸胺、SDS(美國(guó)Pierce公司)，DMEM培養(yǎng)基 (美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(天津?yàn)柟?，ECL發(fā)光液 (北京普利萊公司)，醫(yī)用X光片 (廈門Koda公司)。

細(xì)胞培養(yǎng) 人HEK293T和胰腺癌細(xì)胞系PANC-1用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱中。

融合蛋白E3表達(dá)載體構(gòu)建原則 選取Ras下游效應(yīng)分子 Raf-1［4-5］、PI3K［6］和 RalGDS［7］中 能 夠 與Ras蛋白相互作用的氨基酸片段作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域，E3 泛素連接酶 TrCP［8］和 CHIP［9］中的 F-Box 和 U-Box作為功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域通過GS(胱氨酸和絲氨酸)重復(fù)片段相串聯(lián)，并在C-末端引入Myc標(biāo)簽，便于后期在蛋白水平直接檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況 (圖1)。其中連入的由GS重復(fù)序列構(gòu)成的寡氨基酸片段具有較好的柔韌性，能夠使其兩端的多肽片段具有相對(duì)自由的活動(dòng)空間以利于形成正確的空間構(gòu)型。

引物設(shè)計(jì)和合成 上游引物設(shè)計(jì)原則為:5'-保護(hù)堿基-酶切位點(diǎn)-ATG-核甘酸序列-3'，下游引物中避開終止密碼子，使擴(kuò)增片段連入pcDNA3.1載體后能夠與該載體自帶的Myc標(biāo)簽序列通讀。為了保證所截取的多肽片段能夠有效表達(dá)，并在真核細(xì)胞內(nèi)折疊成正確的空間構(gòu)型，分別向選取片段的上下游各延伸5～10個(gè)氨基酸 (相當(dāng)于15～30個(gè)核苷酸序列)。表1列出了擴(kuò)增各核苷酸片段所用的引物，均在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;表2列出了截取的多肽片段在原蛋白分子中的氨基酸位點(diǎn)及選用的酶切位點(diǎn)。

RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 參照Trizol Reagent試劑盒說明書，提取組織及細(xì)胞中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因或片段。表3列出了各表達(dá)載體中連入核苷酸的理論數(shù)目。

融合蛋白表達(dá)的檢測(cè) 用RIPA裂解液處理瞬時(shí)轉(zhuǎn)染E3表達(dá)載體48 h后的HEK293T細(xì)胞，提取相應(yīng)的蛋白，以β-actin作為內(nèi)參，采用Western blot方法對(duì)不同處理組中攜帶有Myc標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。表3列出了各融合蛋白分子氨基酸理論數(shù)目及相應(yīng)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量。

圖1 融合型泛素連接酶E3表達(dá)載體構(gòu)建原則Fig 1 Construction of the chimeric E3s expression plasimds

表1 擴(kuò)增各片段的引物序列Table 1 Sequences of the primers

表2 各多肽片段在原蛋白分子中的氨基酸位點(diǎn)及載體構(gòu)建中選用的酶切位點(diǎn)Table 2 Sites of the amino acid and the restriction enzyme cutting

表3 各個(gè)融合蛋白理論分子大小Table 3 Molecular weight of all the chimeric proteins in therory

結(jié) 果

E3表達(dá)載體的鑒定 將表達(dá)載體經(jīng)相應(yīng)的雙酶切后，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶切片段，結(jié)果顯示所獲得的6個(gè)重組質(zhì)粒連入了相應(yīng)大小的核苷酸片段 (圖2)。以E3表達(dá)載體作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到了相應(yīng)大小的核苷酸片段 (圖3)。最終經(jīng)測(cè)序證實(shí)，所有表達(dá)載體連入的核苷酸序列是正確的 (圖4)。

圖2 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證E3表達(dá)載體雙酶切片段Fig 2 Identification of the double digestion E3 fragments by 10%polyacrylamide gel electrophoresis

E3表達(dá)載體在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有效性驗(yàn)證 將所構(gòu)建的6個(gè)E3表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，裂解后上樣檢測(cè)各重組質(zhì)粒Myc標(biāo)簽表達(dá)情況。設(shè)立pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，以管家基因β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示除RADPI3K-F-Box-pcDNA3.1重組質(zhì)粒未見表達(dá)，其余5個(gè)重組質(zhì)粒在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48 h即有表達(dá)，所表達(dá)融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的大小和理論值基本一致 (圖5)。

圖3 PCR驗(yàn)證E3表達(dá)載體連入的核苷酸序列Fig 3 Identification of the sequences of the chimeric E3 plasmids by PCR

圖4 各E3表達(dá)載體測(cè)序圖譜Fig 4 Sequencing map of the E3 chimeric plasmids

圖5 各E3表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48 h后融合蛋白的表達(dá)Fig 5 Expression of the chimeric proteins in HEK293T cells after 48 hours of transient transfection

E3表達(dá)載體敲減PANC-1細(xì)胞中Ras蛋白有效性驗(yàn)證 將所構(gòu)建的6個(gè)E3表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，并于轉(zhuǎn)染后48 h和72 h收集細(xì)胞，裂解后上樣檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性Ras蛋白水平，同時(shí)檢測(cè)各個(gè)重組質(zhì)粒Myc標(biāo)簽表達(dá)情況，設(shè)立未處理組、Lipofectamine2000單獨(dú)處理組及pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，以管家基因β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示 (RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1組在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h均降解了Ras蛋白 (圖6)。

圖6 各E3表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞48 h和72 h后內(nèi)源性Ras蛋白表達(dá)水平Fig 6 Expression levels of endogenous Ras in PANC-1 cells after 48 or 72 hours of transient transfection of the E3 plasmids

討 論

Ras基因編碼具有GTP酶活性的膜相關(guān)蛋白［10］，當(dāng)Ras基因突變后，其編碼產(chǎn)物與GTP結(jié)合處于持續(xù)活化狀態(tài)，能夠引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌［11］、結(jié)腸癌［12］、肺癌［13］等多種人類惡性腫瘤中存在著較高頻率的Ras基因點(diǎn)突變，具有該突變的患者生存率明顯低于未突變者。以往人們利用反義寡核苷酸和RNAi技術(shù)在基因水平成功沉默了Ras的表達(dá)，為臨床應(yīng)用基因手段治療惡性腫瘤帶來了革新［14-15］。不同于基因水平的沉默手段，蛋白質(zhì)敲減技術(shù)是構(gòu)建某個(gè)能夠與靶蛋白特異結(jié)合的融合型泛素連接酶E3，直接在蛋白水平實(shí)現(xiàn)對(duì)某種癌蛋白的降解。融合型E3原則上含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與選定的底物結(jié)合，功能結(jié)構(gòu)域使被結(jié)合的底物通過泛素-蛋白酶體途徑降解。利用這種技術(shù)路線，研究者已經(jīng)先后在不同腫瘤細(xì)胞內(nèi)成功敲減了諸如 Rb［2-3］、β-catenin［16-17］、CyclinA/CDK2［18］、c-Myc［19］以及 Her-2［20］等癌蛋白，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特性在一定程度上得到了逆轉(zhuǎn)，初步顯示了蛋白質(zhì)敲減技術(shù)作為另一種沉默基因表達(dá)手段的潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究初步嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)敲減原理，選擇Ras癌蛋白作為靶點(diǎn)，將Ras下游3種不同效應(yīng)分子中的RAD/RBD多肽片段分別與兩種不同泛素連接酶的功能結(jié)構(gòu)域F-Box和U-Box融合表達(dá)，共構(gòu)建出6個(gè)融合蛋白表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞后，F(xiàn)-Box-(RBD+CRD)Raf-1-pcDNA3.1、F-Box-RADRalGDS-pcDNA3.1、(RBD+CRD)Raf-1-U-BoxpcDNA3.1、RADPI3K-U-Box-pcDNA3.1和RADRalGDS-U-BoxpcDNA3.1可以有效表達(dá)出相應(yīng)的目的蛋白，其中(RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1能夠在PANC-1細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)Ras蛋白的降解。

相較于核酸分子較為簡(jiǎn)單的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白分子的空間構(gòu)型要復(fù)雜得多，為了提高融合蛋白E3作用的特異性和有效性，結(jié)構(gòu)域應(yīng)盡可能截取短或小的片段，以排除非相關(guān)結(jié)構(gòu)或序列對(duì)相互作用的干擾。此外，依據(jù) F-Box在 TrCP中位于 N-末端，U-Box在CHIP中位于C-末端，還應(yīng)將F-Box和U-Box放在相應(yīng)融合蛋白的 N-和 C-末端［21］，使連入的多肽片段能夠折疊成正確的空間構(gòu)型以發(fā)揮正常功能。本研究中，F(xiàn)-Box-RADPI3K-pcDNA3.1重組質(zhì)粒未見表達(dá)，其原因可能是其表達(dá)出的融合蛋白形成了某種不利于在真核細(xì)胞體系中穩(wěn)定存在的空間構(gòu)型，于翻譯后極短時(shí)間內(nèi)被降解，應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段不能被檢測(cè)到［22］。

本研究一系列融合蛋白表達(dá)載體的成功構(gòu)建為在腫瘤細(xì)胞中靶向敲減Ras蛋白的研究工作奠定了基礎(chǔ)，下一步將以 (RBD+CRD)Raf-1-U-Box為研究重點(diǎn)，進(jìn)一步探討該表達(dá)載體發(fā)揮作用的原理和機(jī)制。

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Construction of Chimeric E3s Expression Plasimds Targeting Oncoprotein Ras

MA Yi-hui1，2，ZHANG Qiang1，GU Yu-mei1，LU Zhao-hui1，CHEN Jie1

1Department of Pathology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China2Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

CHEN Jie Tel:010-69155490，E-mail:xhblk@163.com

ObjectiveTo construct certain chimeric E3s expression plasmids targetting oncoprotein Ras by harnessing the theory of protein knockdown.MethodsWe chose the binding domain of Raf-1，PI3K，Ral-GDS，and the function domain of F-Box as well as the U-Box to construct the plasmids.Then used the double enzyme，PCR，and sequence to test the validity and integrity of the cloned nucleotide fragments.The expression efficiency of the plasmids in eukaryotic cells was detected by Western blot analysis.ResultsFive of 6 plasmids in this study expressed the corresponding fusion proteins in HEK293T cells，and(RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1 can knocked down the protein level of Ras in PANC-1 cells.Conclusions We successfully constructed the chimeric E3 expression plasmids，which provides a solid basis for further research on protein knockdown.

ubiquitin;proteasome;ubiquitin ligase;Ras

國(guó)家自然科學(xué)基金 (30270599、3047197、30973470、81172334)、衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目 (200802011)和教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (20060023013)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30270599，3047197，30973470，81172334)，the Ministry of Health Industry Scientific Research Projects(200802011)，and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(20060023013)

陳 杰 電話:010-69155490，電子郵件:xhblk@163.com

R446.8

A

1000-503X(2012)04-0313-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.001

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):313-318

2011-11-24)

·論 著·