GPC3、Hep-Par-1在肝細胞癌中的表達及其價值

陳遠欽 邱建龍 張永輝 陳婷婷 鄭素瓊

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤之一[1]，在中國的發(fā)病率居高不下，在惡性腫瘤中位居第2位。HCC的組織形態(tài)復雜多變，一些高分化腫瘤與正常肝組織或良性肝腫瘤難以鑒別，低分化腫瘤需與轉(zhuǎn)移癌鑒別，因此經(jīng)常需要免疫組化來輔助診斷。以往較常用于HCC診斷的抗體有AFP、CD34及CK8等，但應用價值相對有限。20世紀90年代以來，肝細胞單克隆抗體Hep-Par-1及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Hep-Par-1在判斷腫瘤是否為肝細胞來源方面具有重要的診斷價值，被推薦為診斷HCC的一線抗體之一[2]。GPC3是近年來較熱門的1種用于肝細胞癌診斷的標記物，因其敏感性好、特異性高，被認為可能是1種新型癌胚因子[3]。本文應用免疫組織化學方法，對64例HCC分別進行GPC3及Hep-Par-1抗體標記，探討其在HCC診斷與鑒別診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機抽取解放軍180醫(yī)院病理科1998～2011年手術(shù)切除的肝癌組織標本64例。年齡22～79歲，中位年齡55歲，其中男性56例，女性8例。按照2008版WHO組織學分類標準將HCC分為高分化6例、中分化28例、低分化30例。另選取28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC等作為對照研究。選取病例均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法

所有選取標本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、制片。免疫組織化學采用EliVision法(產(chǎn)品編號：KIT-9903)，人抗Glypican-3(GPC3)、Hep-Par-1等試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作嚴格按產(chǎn)品說明書進行。

1.3 結(jié)果判定

GPC3陽性定位于胞質(zhì)或胞膜，Hep陽性定位于胞質(zhì)。染色程度評分標準：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞評分標準：顯微鏡下隨機取5個高倍鏡視野，根據(jù)每個視野中陽性細胞比例進行評分：陽性細胞數(shù)< 5%為0分，5%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分。免疫組化結(jié)果評價標準：上述兩項得分相乘，0分為"-"，1～2分為"+"，3～5分為"++"，6分以上為"+++"。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 GPC3表達情況

64例HCC中58例胞質(zhì)/胞膜呈陽性表達，GPC3表達率為91%(58/64)，其中75%(48/64)呈強陽性表達(+++)，在28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC中均無表達(表1)。GPC3在HCC中表達率顯著高于其他非HCC腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 Hep-Par-1表達情況

64例HCC中52例胞質(zhì)呈陽性表達，Hep-Par-1表達率為81%(52/64)；28例癌旁肝組織、2例HA及6例FNH中Hep-Par-1表達率為100%；1例MAC呈陽性表達，表達率為9%(1/11)；12例ICC中無表達(表1)。肝細胞來源的腫瘤組織中Hep-Par-1表達率顯著高于其他腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 GPC3和Hep-Par-1在不同組織中的表達情況(例，%)

2.3 GPC3與Hep-Par-1表達的相關(guān)性

GPC3和Hep-Par-1均與HCC組織學分化相關(guān)，腫瘤組織學分化越低，GPC3表達率越高，表達強度越強；低分化HCC中Hep-Par-1表達率明顯低于高分化HCC，并且腫瘤組織學分化越低，其表達強度越弱(表2)；GPC3表達與Hep-Par-1表達無明顯相關(guān)性。

表2 GPC3和Hep-Par-1表達與HCC組織學分化的相關(guān)性(例，%)

3 討論

1996年P(guān)ilia等[4]首先描述了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)，把它列為硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員。GPC3通過糖基磷脂酰肌醇(GP I)結(jié)合于細胞表面[5]。研究表明，GPC3通過增強自分泌或旁分泌Wnt基因表達信號來刺激體內(nèi)和體外HCC腫瘤細胞生長，在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變和持續(xù)增殖中發(fā)揮著特殊作用[6]。GPC3在人體胚胎期的胎盤、胚肝、胚肺和胚腎中都有表達，成人后喪失表達。1997年Hsu等[7]首次報道了GPC3在HCC中的表達情況，在154例HCC組織中，74.8%檢測到GPC3mRNA，而在正常肝和肝炎組織中只有3.2%檢測到GPC3基因。Coston等[8]通過免疫組織化學檢測了107例HCC，其中94例(84%)GPC3呈陽性表達，而在225例非HCC的癌癥中只有7例(3%)發(fā)現(xiàn)有GPC3陽性染色。GPC3在肝外腫瘤鮮見表達，主要見于肺鱗癌、卵巢癌、乳腺癌及部分生殖細胞腫瘤等[9,10]。在本組HCC病例研究中，GPC3陽性率達91%(58/64)，略高于文獻報道。在28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC均無表達，故特異性達100%。GPC3在本組HCC中具有高的敏感性及特異性特點，與文獻報道的基本符合，表明在HCC與其他肝臟常見惡性腫瘤的鑒別診斷中具有重要應用價值。本組病例癌旁肝組織中未有表達，與有關(guān)文獻不相一致，可能與研究病例較少或者結(jié)果判讀不同有關(guān)。GPC3在HCC中多數(shù)為彌漫強陽性表達(評分2分以上占95%)，故在肝針吸活檢小標本中有較高的應用價值。另外，隨著組織學分化越低，GPC3表達率越高，表達強度越強，然而，葉玉清等[11]研究顯示，GPC3在肝未分化癌中表達缺失，提示GPC3可能在腫瘤進展中起特殊作用。

Hep-Par-1是Wennerberg等[12]在1993年以石蠟包埋的肝組織作為抗原克隆出的一株新的單克隆抗體，是1種線粒體相關(guān)抗原。Amarapurkar等[13]研究顯示Hep-Par-1在鑒別HCC、肝內(nèi)ICC、MAC中發(fā)揮著非常重要作用，其敏感性及特異性分別為89%及96%。Hep-Par-1在肝外的表達主要見于消化道腫瘤中，國內(nèi)周新木等[14]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)Hep-Par-1在胃癌中表達率達55.4%(72/130)。Hep-Par-1在其他腫瘤中研究較少，且僅偶見表達[15]。我們的研究中，Hep-Par-1在HCC中陽性率為81%，在2例HA、6例FNH、28例癌旁肝組織中均為彌漫陽性表達，因而，Hep-Par-1對肝細胞來源的腫瘤無鑒別診斷作用。在11例MAC中1例陽性表達，這一病例形態(tài)學表現(xiàn)為肝樣腺癌，已證實為胃癌來源，其余10例MAC為非胃癌來源，均未見表達。在12例ICC中無表達。故Hep-Par-1對HCC與ICC、MAC鑒別有較高的敏感性及特異性。

在本組HCC病例中，GPC3陰性者Hep-Par-1表達率為100%(6/6)，Hep-Par-1陰性者GPC3表達率為92%(11/12)，與單獨使用GPC3或Hep-Par-1的陽性率無明顯差異，顯示GPC3及Hep-Par-1在HCC中的表達可能無明顯相關(guān)性。我們在研究中還發(fā)現(xiàn)，兩者同時為陽性HCC病例占70%(45/64)，至少1種標記物陽性HCC病例占98%(63/64)，僅有1例HCC中兩者表達均為陰性，故聯(lián)合使用可提高HCC檢出敏感性。另外，GPC3表達在HCC中的特異性遠高于Hep-Par-1，因此，雖然聯(lián)合應用有助提高檢測敏感性，但不影響其特異性。

綜上所述，GPC3及Hep-Par-1在HCC中均顯示出較高的陽性率，前者在特異性上明顯高于后者，聯(lián)合使用可提高HCC的檢出敏感性，且不影響特異性。兩者在HCC與ICC、MAC鑒別中均有較高的應用價值。GPC3可作為HCC診斷的首選一線抗體。

[1] Robert WCP,Jae WJ,Philip JJ,et al.Biology of hepatocellular carcinoma〔J〕.Ann Surg Oncol,2008,15(4):962.

[2] 叢文銘,譚 璐,張樹輝,等.肝癌免疫組化診斷譜的研究和應用〔J〕.中華腫瘤雜志,2002,24(6):553.

[3] Morford LA,Davis C,Jin L,et al.The oncofetal gene glypican 3 is regulated in the postnatal liver by zinc fingers and homeoboxes and in the regenerating liver by alpha-fetoprotein regulator〔J〕.Hepatology,2007,46(5):1541.

[4] Pilia G,Hughes-Benzie RM,MacKenzie A,et al.Mutations in GPC3,a glypican gene,cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome〔J〕.Nat Genet,1996,12(3) :241.

[5] VeugelersM,Cat BD,Muyldermans SY,et al.Mutational analysis of the GPC3/GPC4 glypican gene cluster on Xq26 in patients with Simpson-Golabi-Behmel syndrome:identification of loss of function mutations in the GPC3 gene〔J〕.Hum Mol Genet,2000,9(9):1321.

[6] Capurro MI,Xiang YY,Lobe C,et al.Glypican-3 promotes the growth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical wnt signaling〔J〕.Cancer Res,2005,65(14):6245.

[7] Hsu HC,Cheng W,Lai PL.Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma:biological significance and temporospatial distribution〔J〕.Cancer Res,1997,57(22):5179.

[8] Coston WM,Loera S,Lau SK,et al.Distinction of hepatocellular carcinoma from benign hepatic mimickers using Glypican-3 and CD34 immunohistochemistry〔J〕.Am J Surg Pathol,2008,32(3):433.

[9] Zhu Z,Friess H,Kleeff J,et al.Glypican-3 expression is markedly decreased in human gastric cancer but not in esophageal cancer〔J〕.Am J Surg,2002,184 (1):78.

[10] Debra L,Zynger,Michael J,et al.Expression of Glypican 3 in Ovarian and Extragonadal Germ Cell Tumors〔J〕.Am J Clin Pathol,2008,130(10):224.

[11] 葉玉清,王鳳華,黃香婷,等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表達在肝細胞癌診斷中的意義〔J〕.中華病理學雜志,2011,40(9):626.

[12] Wennerberg AE,Nalesnik MA,Coleman WB.Hepatocyte-paraffin 1:a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors〔J〕.Am J Pathol,1993,143(4):1050.

[13] Amarapurkar AD,Rega JD,Joshi AS,et al.Utilization of-anti-hepatocyte clone OCH1E5(HepPar-1) in histological evaluation of liver tumor〔J〕.India J Pathol Microbiol,2006,49(3):341.

[14] 周新木,徐少杰,朱憶凌,等.CDx2和Hep在胃癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.中國基層醫(yī)藥,2006,13(12):1947.

[15] Gulluoglu MG，Karayigit E，Ozden I，et al.Does HepPar-1 immunoexpression have a role in differential diagnosis of periampullary cancer〔J〕.Pathology,2008,40(1):35.