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    化學(xué)發(fā)光檢測在微流控芯片中的應(yīng)用綜述

    2012-01-08 09:24:44奚忠華許丹科
    化學(xué)研究 2012年3期
    關(guān)鍵詞:微流磁珠化學(xué)發(fā)光

    奚忠華,許丹科

    (南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,生命分析化學(xué)國家重點實驗室,江蘇 南京210093)

    化學(xué)發(fā)光檢測在微流控芯片中的應(yīng)用綜述

    奚忠華,許丹科*

    (南京大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,生命分析化學(xué)國家重點實驗室,江蘇 南京210093)

    綜述了近年來化學(xué)發(fā)光檢測在微流控芯片中的應(yīng)用.指出微流控芯片(又稱為“芯片實驗室”或者“微型全分析系統(tǒng)”)因具有小型化、集成化和自動化等特點而在近20年來日益受到關(guān)注,而化學(xué)發(fā)光檢測具有儀器結(jié)構(gòu)簡單、背景噪音低、操作和維護成本低等優(yōu)點,非常適合用作微流控芯片的檢測手段.

    化學(xué)發(fā)光檢測;微流控芯片;應(yīng)用;綜述

    20世紀90年代,MANZ等提出了以微機電加工技術(shù)為基礎(chǔ)的“微型全分析系統(tǒng)”(μTAS).μTAS的目的是通過化學(xué)分析設(shè)備的微型化與集成化,最大限度地把分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中,甚至是芯片上.因此本領(lǐng)域有一個更通俗的名稱“芯片實驗室”(LOC).目前在微流控芯片分析中應(yīng)用最廣泛的檢測器類型包括:激光誘導(dǎo)熒光檢測器,電化學(xué)檢測器以及質(zhì)譜檢測器.這三類檢測器都具有很高的靈敏度,但是激光誘導(dǎo)熒光檢測器和質(zhì)譜這兩種檢測器需要使用復(fù)雜和昂貴的設(shè)備,同時也難于實現(xiàn)手持化.電化學(xué)檢測由于其高靈敏度、儀器結(jié)構(gòu)簡單和低成本,在微流控設(shè)備小型化研究方面取得了顯著進步,但是在實際使用時,真實樣品容易污染電極表面從而影響檢測.化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)不需要光源,避免了背景光及瑞利散射等雜散光的干擾,并能夠提供與激光誘導(dǎo)熒光檢測相近的靈敏度,同時具有儀器結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、線性范圍寬、分析速度快、價格便宜等優(yōu)點,有利于微流控芯片分析系統(tǒng)的集成化和智能化,能實現(xiàn)真正意義上的微型化,因而成為微流控芯片最具吸引力的檢測方法之一.

    1 化學(xué)發(fā)光檢測

    化學(xué)發(fā)光是由化學(xué)反應(yīng)所釋放的化學(xué)能激發(fā)了體系中某種化學(xué)物質(zhì)分子,當受激的分子躍遷回到基態(tài)時而產(chǎn)生的光發(fā)射.根據(jù)化學(xué)發(fā)光的強度測定物質(zhì)含量的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法.化學(xué)發(fā)光法由于它具有儀器簡單、檢測限低、線性范圍寬等優(yōu)點,在化學(xué)分析方面越來越受到關(guān)注.與分光光度法和熒光光度法相比,化學(xué)發(fā)光法不需要外光源,從而減少了瑞利散射和拉曼散射,降低了噪音信號的干擾,提高了檢測的靈敏度,擴大了線性動態(tài)范圍.目前化學(xué)發(fā)光分析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)、食品和藥品等領(lǐng)域.

    1.1 化學(xué)發(fā)光檢測器

    微流控化學(xué)發(fā)光分析中化學(xué)發(fā)光檢測器是采集信號的關(guān)鍵.目前在微流控化學(xué)發(fā)光分析中常用的檢測器主要有:光電倍增管(PMT)和CCD檢測器.另外,一些能集成至芯片的檢測器也有報道,如光敏膠片[1]、CMOS陣列[2]、薄膜晶體管光敏器件[3]、薄膜有機光電二極管[4]、硅光電探測器[5]等.光電倍增管檢測器具有很高的靈敏度,非常適合單通道的信號檢測.CCD檢測器則是一個二維的檢測器,雖然靈敏度不如PMT檢測器,但是由于其二維特性決定了它是一個非常好的多通道檢測器,因而在需要多通道檢測或多點檢測時CCD檢測器是更優(yōu)的選擇.如在使用微陣列的微流控芯片中,都采用CCD作為檢測器.對于多通道的檢測還可以使用光敏膠片,膠片集成在芯片上,測試完成后再取下分析數(shù)據(jù).薄膜晶體管光敏器件和薄膜有機光電二極管同樣可以集成在芯片上,與化學(xué)發(fā)光源直接接觸,光子收集效率較高,可提供媲美光電倍增管的靈敏度.

    1.2 化學(xué)發(fā)光試劑

    化學(xué)發(fā)光試劑的使用是整個微流控化學(xué)發(fā)光分析的關(guān)鍵,一般來講化學(xué)發(fā)光試劑在分析過程中的使用類型主要有以下幾種:第一種是待測物為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的催化劑,或者是可以顯著增強化學(xué)發(fā)光的增強劑,此類物質(zhì)可通過直接檢測化學(xué)發(fā)光強度來確定待測物的含量.第二種是待測物可猝滅化學(xué)發(fā)光過程,這樣也可以通過檢測化學(xué)發(fā)光強度的變化來確定待測物含量.第三種情況是更為普遍的,即待測物與化學(xué)發(fā)光試劑本身無作用,這時一般需對待測物進行標記,使其具有催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的能力,或者加入試劑與待測物反應(yīng)生成可檢測物質(zhì),其檢測過程類似第一種情況.表1對文中所列參考文獻使用的化學(xué)發(fā)光試劑進行了簡單小結(jié).

    表1 微流控芯片中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)常用試劑和分析物Table 1 Analytes and chemiluminescence reagents reported on microfluidic chip

    2 均相微流控-化學(xué)發(fā)光分析

    2.1 芯片電泳-化學(xué)發(fā)光分析(MCE-CL)

    芯片電泳(MCE)的分離原理同毛細管電泳類似.芯片電泳以電滲流作為流體驅(qū)動力,一般采用十字通道來進樣(HUANG等曾報道過使用流動注射技術(shù)來為芯片電泳進樣[6])和分離,同時芯片上帶有多個儲液池,使用時還需要高壓電源提供動力.MCE-CL分析系統(tǒng)可應(yīng)用于生物分子檢測[7-9],免疫分析[10-11],單細胞成分分析[12-15],金屬離子的檢測[16-19],抗氧化劑檢測[20],藥物分析[21]等方面.

    ZHAO等[12]設(shè)計了一套微流控化學(xué)發(fā)光檢測分析系統(tǒng)用于單細胞成分檢測,并成功地應(yīng)用于血紅細胞中谷胱甘肽含量的測定,其結(jié)構(gòu)見圖1.微流控芯片安裝在一臺倒置顯微鏡上,顯微鏡的作用是觀察樣品進樣時待分析細胞的位置,便于控制電壓和時間,確保細胞進入分離通道.細胞內(nèi)的谷胱甘肽首先使用重氮魯米諾標記,然后單細胞進樣,并在線加電壓解離,接著芯片電泳分離.樣品分離后與氧化劑次溴酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,光線經(jīng)顯微鏡的透鏡進入安裝在顯微鏡上的光電倍增管轉(zhuǎn)換成點信號并被計算機軟件記錄下來.使用此系統(tǒng)檢測谷胱甘肽的含量其線性范圍在0.2~9.0×10-17mol,檢測限可以達到5×10-20mol(或3.6×10-9mol/L).與以往報道的激光誘導(dǎo)熒光檢測單細胞中谷胱甘肽含量的方法相比,此方法靈敏度要高100倍.同樣利用此系統(tǒng),ZHAO等還分析了多種細胞中的成分,如對大鼠肝細胞中的維生素C和氨基酸(色氨酸,甘氨酸,丙氨酸)的檢測[13],對血紅細胞中的巰基化合物(半胱氨酸,谷胱甘肽,血紅素)的檢測[14],以及在大鼠纖維肉瘤細胞中?;撬岷桶被幔ū彼?,甘氨酸,色氨酸,谷氨酸,天冬氨酸)含量的定量分析[15].除了可以對單細胞進行分析外,該系統(tǒng)還可以用于其他生物樣品的分析[8-9].

    圖1 用于單細胞檢測的MCE-CL系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖[12]Fig.1 Schematic of the integrated MCE-CL system for single cell analysis[12]

    KAZUHIKO等[18]使用MCE-CL系統(tǒng)檢測了金屬離子,采用十字交叉通道的微流控芯片,光電倍增管直接面對電泳通道末端廢液池,檢測化學(xué)發(fā)光強度.經(jīng)電泳分離進入廢液池的金屬離子作為催化劑催化1,10-菲咯啉和 H2O2的化學(xué)發(fā)光反應(yīng).使用該方法分析 Ru(III),Rh(III),Pd(II),Os(VIII),Ir(III)和Pt(IV)的混合溶液,只需要2.5min,對Os(VIII)的檢測限可達到7.5×10-12mol/L,對Cu(II)的檢測限可達到7.5×10-9mol/L.WANG等[19]采用金屬離子作為待分析物來檢驗其設(shè)計系統(tǒng)的可靠性,由于采用了環(huán)形通道來增加光強信號,對Cu(II)的檢測可以獲得更低的檢測限,為1.1×10-10mol/L.

    KAZUHIKO等[20]使用MCE-CL系統(tǒng)分析抗氧化物的含量.芯片的廢液出口不采用廢液池形式而是另加上了一路微流管道用于廢液排出和H2O2引入,微流管道用黑膠帶纏繞,于分離通道末端結(jié)合部設(shè)置一個檢測窗口(2mm×2mm),用于檢測化學(xué)發(fā)光信號.由于魯米諾和催化劑Cu(II)已經(jīng)加至緩沖液中,所以系統(tǒng)運行過程中檢測器會一直檢測到化學(xué)發(fā)光,而當抗氧化劑峰出現(xiàn)時,由于其對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)會起猝滅作用,化學(xué)發(fā)光強度因此下降,在譜圖上出現(xiàn)負峰.利用該芯片,他們成功地實現(xiàn)硝基四氮唑和超氧化物歧化酶的分離和檢測.

    ZHAO等[22]將化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移應(yīng)用于芯片電泳的信號檢測.魯米諾和次溴酸鈉的化學(xué)發(fā)光體系中加入CdTe量子點,能觀察到明顯的化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移,而一些有機物(如生物體內(nèi)的氨基酸等)的存在會抑制該過程,這種抑制作用反映到芯片電泳譜圖上就是信號的降低(負峰).應(yīng)用此體系數(shù)十種氨基酸被成功地分離與檢測,且檢測靈敏度比以往的MCE-CL方法要高10倍至1 000倍.

    芯片電泳作為一種分離手段在微流控芯片的未來發(fā)展中仍然占據(jù)一個重要地位,它會被作為一個分離單元集成到一個微流控芯片中.

    2.2 基于流動注射(FI)的微流控-化學(xué)發(fā)光分析

    流動注射分析作為一種自動采樣及樣品前處理的技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用.基于流動注射分析技術(shù)發(fā)展的微流控芯片分析,可以稱之為微流動注射芯片.此類芯片可用于離子檢測[23-24],環(huán)境分析[25-27],藥物分析[28]以及葡萄糖[29]和氨基酸[30]等的檢測.在簡單的流通式微流動注射芯片上還可以集成控制流體的微閥[31-33],微反應(yīng)器[29]以及加入固定相[31-32,34-35],集成的這些新單元可以拓展微流動注射芯片的使用范圍.

    徐溢[29]設(shè)計了一種帶微混合器和反應(yīng)器的芯片用于葡萄糖的檢測.葡糖糖經(jīng)葡萄糖氧化酶氧化生成H2O2,H2O2在過氧化物酶的催化下與魯米諾發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),從而間接完成對葡萄糖的檢測.LI等[33]設(shè)計了一種用于微流動注射芯片的熱驅(qū)動微閥,該閥以聚N-異丙基丙烯酰胺為材料,這種高分子凝膠由于較低的臨界溶解溫度(32℃)使其可以快速地進行相轉(zhuǎn)變.通過控制閥體的溫度來控制閥打開或關(guān)閉,通過多個閥體的組合,可以方便地控制芯片通道內(nèi)流體的流向,從而完成樣品的導(dǎo)入,并且進樣量具有較高的穩(wěn)定性.

    從目前的發(fā)展來看,微流動注射技術(shù)也是微流控芯片的一個組成部分,它與其他技術(shù)一起組成一個功能復(fù)雜且自動化的芯片實驗室.

    3 非均相微流控-化學(xué)發(fā)光分析

    非均相微流控化學(xué)發(fā)光分析一般有兩種形式,一種是基于微流控芯片通道內(nèi)部的,具體方式可以是直接在通道內(nèi)部進行化學(xué)修飾,或者是在微流控芯片制作時將生物芯片(微陣列)引入其通道底部.另一種是在芯片內(nèi)引入其他物質(zhì)作為載體,此類物質(zhì)一般安置在芯片上特別設(shè)計的反應(yīng)池內(nèi),具體有微珠(玻璃珠,磁珠或高分子小球)、分子印跡材料、離子交換樹脂等各類材料.其中磁珠由于其特有的磁性,可以通過磁場來控制,安置位置更具靈活性.

    3.1 基于通道內(nèi)部修飾的微流控化學(xué)發(fā)光分析

    BHATTACHARYYA等[1]設(shè)計了一種直接在芯片通道底部進行化學(xué)修飾的多通道微流控芯片,用于疾病的生物標識物的檢測,由于芯片是多通道的設(shè)計,因此可以同時在不同通道中進行多個樣品的運行.作者使用了兩種檢測方法檢測信號,一種方式是使用可檢測化學(xué)發(fā)光信號的成像儀;另外一種是使用可快速曝光的膠片.對于得到的信號使用來自Bio-Rad的“Quantity One”分析軟件處理計算出的信號強度.使用此系統(tǒng)對C反應(yīng)蛋白的測試結(jié)果與使用標準的ELISA方法得到的結(jié)果吻合.

    WANG等[5]設(shè)計了一個微流控芯片用于CD4+T細胞的計數(shù)分析,芯片通道由許多微柱組(一個中心圓柱和周圍3個弧形柱為一組)組成.通道內(nèi)首先修飾抗體(anti-CD4),anti-CD4抗體會結(jié)合樣品中的單核白血細胞和T細胞,再加入HRP標記的anti-CD3抗體,該抗體只與T細胞作用,最后通入化學(xué)發(fā)光試劑產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,通過一個硅光電探測器轉(zhuǎn)換成光電流,通過電流大小得出細胞的數(shù)目.

    WEBSTER等[36]設(shè)計了一個微流控芯片卡盒可用于過敏原等其他多組分樣品的檢測,卡盒上集成5個試劑池和5個微泵以及一個反應(yīng)區(qū)(底層材料為黑色硅橡膠,黑色方便化學(xué)發(fā)光檢測)和一個廢液池,其中反應(yīng)區(qū)的通道內(nèi)固定微陣列.在芯片加工成型后,反應(yīng)區(qū)硅橡膠上噴涂上多孔的硝化纖維素層,待硅橡膠烘干后再將過敏原提取物和其他分析目標物通過點樣方式在通道內(nèi)排成陣列,試樣烘干后再將芯片封裝好,進行測試,測試時使用一套優(yōu)化好的步驟自動進行,最后的化學(xué)發(fā)光通過CCD檢測器來檢測,整套系統(tǒng)全部由計算機控制.通過此種方法可獲得比目前市場上過敏原定量分析方法更高的精確度.

    CHRISTOPHE等[37-38]提出了一種名叫“macromolecules to PDMS transfer”的方法,使用該方法可以將蛋白質(zhì)固定在PDMS芯片表面.在他們的工作中,兔IgG或C反應(yīng)蛋白抗體溶液通過點樣儀點樣至特氟隆陽模上,待溶液干后將液態(tài)的PDMS澆至其表面,再待PDMS固化后將PDMS膜從模具上取下,這樣就得到表面帶有蛋白點的PDMS膜.使用這種膜可以用來捕捉類風(fēng)濕因子和游離C反應(yīng)蛋白,接著再與過氧化物標記的抗體結(jié)合進行化學(xué)發(fā)光檢測.CHRISTOPHE等[39]為此類PDMS生物芯片制作了一個微流控芯片,該芯片在每組點樣點上方設(shè)置一個反應(yīng)池,各個反應(yīng)池串聯(lián)起來成一個整體.這樣就將生物芯片與微流控芯片結(jié)合起來,使用此芯片檢測過敏原抗體,得到的結(jié)果與Pharmacia公司經(jīng)典的CAP系統(tǒng)的檢測結(jié)果相當.

    3.2 基于微珠的微流控化學(xué)發(fā)光分析

    普通的微流控芯片在進行分析時,通道的表面積較小,修飾后信號可能也無法達到滿意的程度,微珠(microbead,包括玻璃珠、磁珠、高分子小球等多種類型)的使用則可以增加表面積.而微珠中的磁珠更因為具有磁性,易于控制,使用非常廣泛.

    KAZUHIKO等[11]在MCE-CL系統(tǒng)中將玻璃珠置于儲液池中作為免疫分析的媒介檢測腫瘤標識物.首先在樣品儲液池中放置玻璃珠(直徑1mm),玻璃珠上固定抗體,在儲液池內(nèi)進行競爭免疫反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物通過MCE進行分離,最后在廢液池內(nèi)發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),并被上方的光電倍增管記錄信號.

    HUANG等[40]設(shè)計了一種基于磁珠的微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析方法用于檢測甲胎蛋白.磁珠通過芯片通道底部的磁鐵固定在通道內(nèi),測試時打開磁場,首先通入交聯(lián)了甲胎蛋白抗體的磁珠,待沖洗后,再加入甲胎蛋白標品,再次沖洗后通入辣根過氧化物酶標記的甲胎蛋白抗體,沖洗后加入化學(xué)發(fā)光試劑,同時檢測化學(xué)發(fā)光信號.最后可以關(guān)閉磁場,再將磁珠排出微流控芯片通道,這樣芯片可以重復(fù)使用.

    ZHENG等[41]在MCE-CL系統(tǒng)中利用磁珠固定酶來催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(辣根過氧化物酶,葡萄糖氧化酶)以此來檢測H2O2和葡萄糖.固定在磁珠上的酶具有很好的催化活性和耐久性,同時由于磁珠良好的分離性,使其重復(fù)使用性也較好,文獻中報道運行20次樣品,信號仍很穩(wěn)定.

    3.3 其他非均相微流控化學(xué)發(fā)光分析

    在微流控化學(xué)發(fā)光分析中除了可以加入微陣列和磁珠外,還可以加入其他類型固定相,如離子交換樹脂[31]、分子印跡材料[32,34-35]等.通過加入固定相可以用來固定反應(yīng)試劑或者捕捉、富集目標分子,從而提高檢測靈敏度.

    劉海生等[26]設(shè)計了一種將微注樣閥和發(fā)光試劑均集成化的微流動注射化學(xué)發(fā)光芯片.芯片制作時留有一個樹脂池,填充陰離子樹脂,陰離子樹脂上固定Luminol和K3Fe(CN)6,這樣就將化學(xué)發(fā)光試劑集成到芯片中.該芯片結(jié)合酶促反應(yīng)成功地用于人體血清中葡萄糖的測定.

    WISANU等[35]設(shè)計了一個基于分子印跡的微流控芯片用于檢測蜂蜜中的氯霉素,其核心部分為微流控芯片上的儲存分子印跡材料的反應(yīng)池,待測物以及化學(xué)發(fā)光試劑等通過注射泵輸入到芯片上的微通道,進而在反應(yīng)池內(nèi)發(fā)生反應(yīng),最后使用光電倍增管檢測反應(yīng)池內(nèi)化學(xué)發(fā)光的強度.使用此方法檢測氯霉素可以得到很好的靈敏度.

    4 展望

    微流控芯片化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用領(lǐng)域很廣.目前主要是向著多通道分析、多樣品分析、自動化集成化分析這幾個方向發(fā)展.目前各個實驗室研制的能實現(xiàn)自動化分析的儀器在多通道能力上尚有欠缺,而且微流控芯片化學(xué)發(fā)光分析還沒有正式的商業(yè)產(chǎn)品推出,可以說今后發(fā)展的道路依然很長.需要解決的問題主要有:(1)設(shè)備的小型化.化學(xué)發(fā)光檢測已經(jīng)為設(shè)備小型化提供了很好的條件,未來研發(fā)新型且低成本的可集成至芯片的二維檢測器將使得分析系統(tǒng)更加小型化.微流控芯片化學(xué)發(fā)光分析離不開化學(xué)發(fā)光試劑,研究試劑集成至芯片的方法也是設(shè)備小型化面臨的一個挑戰(zhàn).(2)使用壽命.現(xiàn)在的微流控芯片的使用壽命都很有限,MCE的芯片使用壽命也就是上百個樣品運行,其他類型的芯片有些甚至是一次性的,這對于大規(guī)模應(yīng)用來說無疑是致命的.(3)多通道多樣品運行.多通道多樣品分析能力是最關(guān)鍵的,它可以大大縮短分析時間并且降低使用成本.目前的多通道檢測一般通過CCD來進行,由于CCD的檢測靈敏度較低,測試時往往需要曝光較長時間(3~10min).這可以通過研制更靈敏的檢測器和新的更強更穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光試劑來解決.

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    Review on application of chemiluminescent detection for microfluidic chip

    XI Zhong-h(huán)ua,XU Dan-ke*
    (State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science,School of Chemistry & Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing210093,Jiangsu,China)

    A review is provided of the application of chemiluminescent detection for microfluidic chip in recent years.It is pointed out that microfluidic chip(also known as“l(fā)ab on a chip”or“micro total analysis system”)has increasingly attracted attention in the past two decades,due to its advantages including miniaturization,integration,and automation.Besides,it is also suggested that chemiluminescence detection has the advantages of simple facility,low background noise,and low costs for operation and maintenance.This makes it feasible to adopt chemiluminescence detection as a suitable detection technique for microfluidic chip.

    chemiluminescent detection;microfluidic chip;application;review

    O 65

    A

    1008-1011(2012)03-0088-07

    2011-11-10.

    奚忠華(1982-),男,碩士生.研究方向:蛋白芯片的化學(xué)發(fā)光檢測和可視化檢測.*

    E-mail:xudanke@nju.edu.cn.

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