7種腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測(cè)宮頸癌的價(jià)值探討

王運(yùn)賢，田淑貞，李留霞，趙 萍

(1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校婦產(chǎn)科教研室，河南南陽(yáng) 473061；2.河南省腫瘤醫(yī)院放療科，河南鄭州 450008；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450052)

宮頸癌作為女性最常見的惡性腫瘤之一，浸潤(rùn)性宮頸癌的5年生存率為67%，早期癌的5年生存率為90%，而原位癌則幾乎達(dá)100%[1]，因此早期診斷宮頸癌是提高宮頸癌患者生存率的關(guān)鍵。人乳頭狀瘤病毒(HPV)檢測(cè)及液基細(xì)胞薄層涂片技術(shù)(TCT)的應(yīng)用對(duì)提高宮頸癌的早期診斷率發(fā)揮了重要作用。近年來(lái)研究表明，腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)在腫瘤尤其惡性腫瘤發(fā)生早期即可在腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身特異性抗體[2-3]，檢測(cè)患者血清中腫瘤自身抗體對(duì)早期診斷肝癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤具有重要意義[4-6]。由于宮頸癌病變接近體表，易于通過(guò)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及宮頸活檢確診，但是宮頸癌病變應(yīng)具有與其他器官腫瘤相似的生物學(xué)特性，腫瘤細(xì)胞是否也能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，至今尚未見到有關(guān)宮頸癌患者血清TAAs自身免疫抗體檢測(cè)的報(bào)道。本研究擬通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)宮頸癌及癌前病變患者血清中的7種自身抗體，分析各單一抗原及不同抗原組合在宮頸癌患者中檢測(cè)的陽(yáng)性率，探討TAAs在檢測(cè)宮頸癌方面的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 采集2008年7月至2010年7月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的45例宮頸癌患者和40例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)患者的血清標(biāo)本；40例健康者血清來(lái)自健康志愿者和體檢檢查結(jié)果正常的健康成人。所有血清標(biāo)本均存放于-80 ℃低溫冰箱。

1.1.2分組 宮頸癌組：宮頸癌患者術(shù)前血清共計(jì)45例，患者年齡26～74歲，平均45.02歲。其中腺癌患者7例，鱗癌患者38例。按FIGO臨床分期：Ⅰ期癌患者25例，Ⅱ期、Ⅲ期癌患者20例。CIN組：CINⅡ和Ⅲ級(jí)患者術(shù)前血清40例，患者年齡24～54歲，平均年齡39.87歲。上述兩組患者均經(jīng)病理證實(shí)。對(duì)照組：健康人血清40例，年齡23～76歲，平均年齡50.97歲。

1.2主要試劑 7種TAAs Koc、CDK2、Survivin、C-myc、p16、CyclinB1和CyclinE均來(lái)自美國(guó)德州大學(xué)生命科學(xué)系分子流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室。Sunrise酶標(biāo)儀為美國(guó)Tecan 公司產(chǎn)品。

表1 單一抗原抗體檢測(cè)陽(yáng)性率結(jié)果[n(%)]

Sur:Survivin;CycB1:CyclinB1;CycE:CyclinE

表2 不同TAA組合的檢測(cè)結(jié)果的評(píng)價(jià)[n(%)]

96孔酶標(biāo)板為Gibico公司產(chǎn)品。其他試劑如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG(HRP-Aps)等均由鄭州大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用研究中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.3方法 采用間接ELISA[7]，各種抗原均以0.5 μg/μL的稀釋濃度包被96孔板，4 ℃孵育24 h棄液，3%明膠封閉1 h；一抗待測(cè)患者血清以1∶50稀釋后每孔加100 μL，磷酸緩沖液 (PBS)作為空白對(duì)照，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；二抗HRP-APs以1∶4 000稀釋每孔加100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次；最后每孔加TMB過(guò)氧化氫尿素顯色液100 μL，37 ℃ 避光反應(yīng)至顯色充分后加終止液(10%硫酸)每孔50 μL，立即在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取450 nm OD值，空白孔調(diào)零。結(jié)果判定：每份待測(cè)血清做兩孔取其平均值，以健康人血清OD的平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為界值即截?cái)嘀?Cut off)，高于此值判為陽(yáng)性，低于此值判為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析各組中陽(yáng)性表達(dá)率，均以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1單獨(dú)檢測(cè)一種抗原抗體的陽(yáng)性率結(jié)果 單獨(dú)檢測(cè)血清中一種抗原抗體，在45例宮頸癌患者中陽(yáng)性率為22.2%～53.3%，以Koc為最高，p16最低；40例CIN患者中陽(yáng)性率為10.0%～30.0%,以Koc為最高，CDK2最低；對(duì)照組陽(yáng)性率均相應(yīng)的低于宮頸腫瘤組，見表1。

2.2不同抗原組合的檢測(cè)結(jié)果及診斷宮頸癌的真實(shí)性評(píng)價(jià) 隨著TAA組合種類的增加，宮頸癌診斷的靈敏度上升到73.3%，明顯高于健康人；而特異度也達(dá)到82.5%，僅降低了12.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值也達(dá)82.5%和73.3%，約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1)為0.558，陽(yáng)性似然比[靈敏度/(1-特異度)]為4.18，見表2。

2.37種TAAs檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果顯示宮頸癌組、CIN組和對(duì)照組的陽(yáng)性率存在總體差異(χ2=26.590，P<0.05)，兩兩比較結(jié)果，宮頸癌組陽(yáng)性率明顯高于CIN組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.083、P<0.05)；宮頸癌組、CIN組陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=26.498，P1<0.05；χ22=7.040，P2<0.05)，見表3。

2.47種TAAs檢測(cè)宮頸癌的陽(yáng)性率在組織學(xué)類型和臨床分期上的差異 7種TAAs檢測(cè)陽(yáng)性率在宮頸鱗癌、腺癌之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ21=0.650，P1>0.05)；CIN與宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=4.539，P1<0.05；χ22=4.848，P2<0.05)；宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.051，P>0.05)，見表4。

表3 7種TAAs聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

表4 不同病理類型和臨床分期檢測(cè)的結(jié)果

3 討 論

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中存有各種類型的抗腫瘤細(xì)胞抗原抗體[8]，腫瘤相關(guān)抗原抗體系統(tǒng)作為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物已成為國(guó)內(nèi)外腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。對(duì)不同腫瘤的研究顯示，單一抗原檢測(cè)某一腫瘤自身抗體時(shí)陽(yáng)性率較低，敏感度和特異度難以滿足臨床需要[9]，聯(lián)合檢測(cè)一組精心挑選的抗原抗體可以提高腫瘤早期診斷的靈敏度，同時(shí)為使抗原聯(lián)合檢測(cè)在臨床應(yīng)用中達(dá)到一定的真實(shí)性，不同類型的腫瘤可能需要不同的抗原抗體組合[10-11]。Survivin、p16、CyclinE、CDK2等蛋白均已被證實(shí)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-15],它們?cè)趦?nèi)在性質(zhì)、作用環(huán)節(jié)、作用機(jī)制上不完全相同，但存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)，可協(xié)同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，有一定的聯(lián)合基礎(chǔ)。

本研究用7種TAAs檢測(cè)宮頸癌，單獨(dú)檢測(cè)1種抗原抗體時(shí)靈敏度較低，最高的Koc為53.3%，最低的p16為22.2%，說(shuō)明上述7種抗原單獨(dú)應(yīng)用時(shí)診斷價(jià)值不大。隨著TAAs組合種類增加，診斷的靈敏度從22.2%上升到73.3%，增加了51.1%，而特異度從95.0%下降到82.5%，只降低12.5%?？傮w看，7種TAA微陣列檢測(cè)結(jié)果較為理想，陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值也達(dá)82.5%和73.3%，約登指數(shù)0.558，陽(yáng)性似然比4.18，提示7種TAAs聯(lián)合檢測(cè)宮頸癌具有一定的臨床價(jià)值。檢測(cè)45例宮頸癌患者及40例CIN患者血清中TAAs抗體，宮頸癌組陽(yáng)性率明顯高于CIN組，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，且宮頸癌組、CIN組血清抗體陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.5)，提示7種TAAs聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷具有一定的參考價(jià)值，且說(shuō)明在宮頸癌前病變期患者血清中已存在TAAs自身抗體的變化，可對(duì)宮頸癌的早期診斷起到預(yù)警作用。進(jìn)一步研究顯示，CIN組與宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是宮頸癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明7種TAAs檢測(cè)陽(yáng)性率與宮頸癌的期別無(wú)相關(guān)性，與癌變具有相關(guān)性，提示血清中免疫學(xué)變化在腫瘤發(fā)生早期已出現(xiàn)，該檢測(cè)方法對(duì)宮頸癌的早期診斷具有一定參考價(jià)值。另外，分析不同病理類型的宮頸癌TAAs檢測(cè)結(jié)果顯示，鱗癌與腺癌之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明7種TAAs檢測(cè)陽(yáng)性率與宮頸癌病理類型無(wú)明顯相關(guān)。

綜上所述，本研究運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)宮頸腫瘤患者血清中的自身抗體，獲得了較有價(jià)值的結(jié)果，提示TAAs在早期診斷宮頸癌方面可能具有一定參考價(jià)值。

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