大鼠ZnT1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定*

胡英明，梅晰凡△，宋長(zhǎng)威，李 諶

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院：1.骨科；2.中心實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121000)

鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(zinc transporter1，ZnT1) 是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員之一,在調(diào)解機(jī)體鋅代謝以及神經(jīng)活動(dòng)過程中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。研究顯示，ZnT1在正常鼠脊髓有少量的分布，在脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后顯著增加，且與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)呈正相關(guān)，提示它可能是調(diào)控內(nèi)源性BDNF表達(dá)量增加，促進(jìn)損傷脊髓神經(jīng)元及其軸突修復(fù)的主要原因[2-4]。然而，SCI后BDNF總量的增加不足以維持損傷處神經(jīng)元的存活和軸突的再生，人們采用外源性BDNF來修復(fù)SCI雖然取得了一定的療效[5-7]，但是，外源性BDNF存在著宿主排斥反應(yīng)、難以通過血腦屏障以及基因治療的長(zhǎng)期安全性等問題。如果能尋找出調(diào)控內(nèi)源性BDNF及其受體表達(dá)的有效途徑，促進(jìn)內(nèi)源性BDNF的合成、釋放及與受體結(jié)合，將在體內(nèi)建立有效的保護(hù)機(jī)制，從而減輕脊髓繼發(fā)性損傷。由Invitrogen公司開發(fā)的GatewayTM技術(shù)是一種基于λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，能夠快速地、特異性地將一個(gè)或多個(gè)目的基因片斷克隆到入門載體[8-9]，該技術(shù)大大地簡(jiǎn)化了基因克隆的步驟，且效率高達(dá)95%或以上[10]。本研究采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建大鼠ZnT1基因重組腺病毒載體，為下一步研究ZnT1基因在脊髓神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)以及與BDNF/TrkB信號(hào)調(diào)節(jié)通路的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 目的基因片段ZnT1/IRES/EGFP委托賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司化學(xué)合成；pDonr221載體供體、pDown入門載體、Ad/CMV/V5-DEST載體、BP ClonaseTM酶、LR ClonaseTM酶Invitrogen公司；PacⅠ、EcoRⅤ、NdeⅠ、BstBⅠNEB公司；質(zhì)粒大提試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自Promega公司；HEK293A細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存； DNA Marker、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1含重組位點(diǎn)attB目的基因片段的獲取 在GenBank中檢索大鼠ZnT1cds序列，委托賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司化學(xué)合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段，采用PCR方法在該基因片段兩側(cè)添加attB重組特異位點(diǎn)，重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增基因片段attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，反應(yīng)產(chǎn)物參照QIAquick的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進(jìn)行回收，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2入門克隆的構(gòu)建 將2 μL目的基因片段、2 μL含有attP位點(diǎn)pDonor221供體載體、1 μL BP ClonaseTM酶和適量TE緩沖液混合25 ℃，BP反應(yīng)3 h，加入蛋白酶K終止反應(yīng)10 min，取反應(yīng)終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Stbl3，轉(zhuǎn)化物涂到含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃孵育過夜，無菌操作下挑取單個(gè)陽性克隆，小量提取質(zhì)粒，并對(duì)提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅤ酶切篩選并送交陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序引物為：Forward，5′-CGG CCA GTC TTA AGC TCG GG-3′；Reverse，5′-AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA-3′。將正確克隆命名為pDown-ZnT1。

1.2.3表達(dá)克隆的構(gòu)建 將1 μL入門克隆產(chǎn)物，1 μL目的載體Ad/CMV/V5-DEST,1 μL的 LR ClonaseTM酶，2 μL的TE緩沖液混合，25 ℃，LR反應(yīng)16 h，使入門克隆與目的載體發(fā)生體外特異位點(diǎn)重組。取反應(yīng)終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌Stbl3，轉(zhuǎn)化物涂到含有氨芐霉素的LB培養(yǎng)基，無菌操作下挑取單個(gè)陽性克隆，小量提取質(zhì)粒，NdeⅠ和BstBⅠ酶切篩選送交陽性克隆測(cè)序鑒定，序引物為：Forward，5′-GAA CCC ACT GCT TAC TGG CTT-3′；Reverse，5′-AGA CCG AGG AGA GGG T-3′。將重組后質(zhì)粒命名為pAd -ZnT1。

1.2.4重組腺病毒載體的包裝與擴(kuò)增 HEK293A細(xì)胞的準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)染前將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293A細(xì)胞用0.25% 胰蛋白酶消化，含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為30%～40%，重新接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及較少的傳代次數(shù)對(duì)于病毒包裝至關(guān)重要。

重組腺病毒顆粒的形成：用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，PacⅠ酶切使其線性化，暴露病毒的ITRs端(inverted terminal repeat sequence，病毒基因組復(fù)制所需的重復(fù)序列)，采用酚/仿異戊醇抽提法提純質(zhì)粒DNA，在Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，當(dāng)有明顯的細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)(CPE)現(xiàn)象，且有大于50%細(xì)胞脫壁時(shí)即收集細(xì)胞。于-80 ℃深低溫冰柜中30 min，37 ℃恒溫水浴箱中20 min反復(fù)凍融3次，室溫下1 000 r/min離心3 min，獲得重組腺病毒顆粒Ad-ZnT1上清液即為原代病毒液，取部分原代病毒液再次感染HEK293A細(xì)胞，獲得較高滴度第2代病毒，如此獲得高滴度的第3代病毒液。

重組腺病毒的滴度測(cè)定：病毒滴度測(cè)定采用終點(diǎn)稀釋法。檢測(cè)前24 h在96孔平底培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100 μL約含104個(gè)HEK293A細(xì)胞的懸液(含5% FBS的DMEM)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育待用。取第3代腺病毒病毒液10 μL加入含有990 μL DMEM的EP管內(nèi)作1∶100稀釋，濃度即為原病毒液的10-2，以此濃度為起點(diǎn)，作病毒液的1∶10倍比稀釋，即成10-3～10-10各種梯度濃度的病毒稀釋液。從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，確定每孔的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好，吸棄舊培養(yǎng)液，然后依次將10-3～10-10稀釋的病毒液加入96孔板中，每一稀釋度占用一行。每一行前10孔加入100 μL病毒稀釋液，第11、12孔均加入100 μL不含病毒的完全培養(yǎng)基作為對(duì)照。培養(yǎng)10 d左右，觀察CPE現(xiàn)象，并對(duì)CPE孔進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算每一行的陽性率，計(jì)算病毒滴度(Spearman-Karber Method):病毒滴度=10(X+0.8)pfu/mL。

1.2.5Western blotting分析重組腺病毒Ad-ZnT1的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組(Ad-ZnT1)、陰性對(duì)照組(Ad-EGFP)用最佳感染復(fù)數(shù)(MOI=100)感染HEK293A細(xì)胞，第3組為正常細(xì)胞。48 h后將培養(yǎng)液棄掉，預(yù)冷的PBS輕洗3次。收集細(xì)胞，通過反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞獲取蛋白。紫外分光光度計(jì)法測(cè)定提取的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳法制備蛋白膠(體積分?jǐn)?shù)5%濃縮液，10%分離膠) 電泳,將蛋白膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用麗春紅染液染色，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗兔抗鼠ZnT1(稀釋比例為1∶500)孵育1 h，TBST中洗滌3次，繼續(xù)用HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔(稀釋比例為1∶5 000)孵育1 h，ECL試劑盒顯色，通過觀察重組腺病毒目的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1含attB位點(diǎn)基因片段合成的鑒定 PCR擴(kuò)增attB1-ZnT1第1外顯子、attB1-ZnT1第2外顯子、IRES/EGFP-attB2基因片段(圖1)，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，泳道1、2、3分別是PCR擴(kuò)增第1外顯子約0.6 kb，第2外顯子約0.9 kb，IRES/EGFP-attB2片段約1.3 kb，重疊延伸PCR后擴(kuò)增基因片段attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2 電泳，片段大小約2.8 kb，為前三者之和，證實(shí)含有attB特異位點(diǎn)的目的基因片段完成連接，見圖2。

圖1 含attB特異位點(diǎn)基因片段的PCR擴(kuò)增

圖2 含attB特異位點(diǎn)基因片段的PCR重疊延伸擴(kuò)增

2.2入門克隆的酶切篩選和測(cè)序鑒定 以EcoRⅤ酶切篩選入門克隆pDown-ZnT1，泳道1～3分別是不同克隆后的酶切結(jié)果，1%瓊脂糖凝膠電泳。泳道3可見有大小約為1.9 kb和 3.3 kb的目的片段，小片段是入門載體pDown骨架部分，這與入門載體骨架大小相符，大片段為含特異位點(diǎn)基因片段部分(圖3)。選取泳道3克隆測(cè)序鑒定(封2圖4)，證實(shí)目的基因已經(jīng)克隆至入門載體中。

圖3 EcoRⅤ酶切篩選陽性入門克隆pDown-ZnT1

2.3重組腺病毒載體的酶切篩選和測(cè)序鑒定 重組腺病毒表達(dá)載體經(jīng)NdeⅠ、BstBⅠ雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約3.3 kb處有目的條帶的強(qiáng)表達(dá)(圖5)，該條帶與入門載體酶切篩選結(jié)果基本符合，證實(shí)經(jīng)過LR反應(yīng)后含有attB特異位點(diǎn)的attB1-ZnT1/IRES/EGFP-attB2基因片段已克隆至表達(dá)載體中。送交陽性克隆測(cè)序鑒定(封2圖6)，目的基因ZnT1克隆至表達(dá)載體中。

圖5 重組腺病毒表達(dá)載體經(jīng)NdeⅠ和BstBⅠ雙酶切

2.4重組腺病毒滴度的測(cè)定 重組腺病毒pAd-CMV-ZnT1/IRES/EGFP按上述終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法測(cè)得各排陽性孔的比率(10-3～10-10梯度稀釋度)分別為1、1、1、0.9、0.7、0.6、0.2、0，X=1+1+1+1+1+0.9+0.7+0.6+0.2+0=7.4，按照(Spearman-Karber Method)方法：毒滴度(pfu/mL)=10(X+0.8)=10(1+1+1+1+1+0.9+0.7+0.6+0.2+0.8)=1.6×108pfu/mL。同理獲得陰性對(duì)照腺病毒Ad-ZnT1滴度為2.5×108pfu/mL。

2.5重組腺病毒感染HEK293A細(xì)胞的熒光表達(dá) 重組腺病毒Ad-ZnT1感染HEK293A細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，正常的多角形HEK293A細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞間隙變大，多個(gè)細(xì)胞聚集呈現(xiàn)葡萄串樣改變，熒光顯微鏡下觀察可見明顯的熒光，見封2圖7。

2.6腺病毒介導(dǎo)的ZnT1基因在HEK293A細(xì)胞中的表達(dá) 目的基因ZnT1表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為36×103，實(shí)驗(yàn)組(A組)、陰性對(duì)照組(B組)感染HEK293A細(xì)胞后48 h，Western blotting結(jié)果顯示A組出現(xiàn)ZnT1特異條帶(圖8)，陰性B組及正常細(xì)胞組均未出現(xiàn)特異條帶。證實(shí)重組腺病毒Ad-ZnT1可高效感染293A細(xì)胞，并有目的基因ZnT1的強(qiáng)表達(dá)。

圖8 Western blotting分析目的基因ZnT1蛋白的表達(dá)

3 討 論

目前，基因治療中常用的生物病毒載體有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體及重組腺病毒載體，其中重組腺病毒載體具有宿主范圍廣，外源性基因插入容量大，病毒滴度高，不整合于宿主基因組，包裝相對(duì)容易，能夠大量擴(kuò)增及構(gòu)建成本低等優(yōu)點(diǎn),腺病毒能感染幾乎所有的細(xì)胞類型,除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞[11-12]，這對(duì)于研究目的基因在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)很有意義。

目前，大多采用Adeasy系統(tǒng)來構(gòu)建重組腺病毒載體，該系統(tǒng)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，添加了實(shí)驗(yàn)所需的酶切位點(diǎn)并在位點(diǎn)前加保護(hù)堿基，先將目的基因和穿梭載體分別進(jìn)行雙酶切鑒定，再由連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選穿梭載體，酶切線性化后和病毒骨架Adeasy在大腸埃希菌BJl83感受態(tài)細(xì)胞中同源重組，挑選陽性克隆，酶切及測(cè)序鑒定后在293細(xì)胞中包裝，整個(gè)過程需要多次酶切，連接和轉(zhuǎn)化篩選并且重組陽性率很低，耗時(shí)長(zhǎng)、工作繁瑣。

本實(shí)驗(yàn)采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建ZnT1腺病毒表達(dá)載體，在此技術(shù)中起到重組作用的位點(diǎn)有attB、attP、attL、attR。實(shí)驗(yàn)中將含有attB位點(diǎn)的基因片段與attP位點(diǎn)的供體載體pDonr221在BP ClonaseⅡ高效酶催化下生成帶有attL位點(diǎn)的入門載體pDown-ZnT1。入門載體再與帶有attR位點(diǎn)的目的載體Ad/CMV/V5-DEST在LR ClonaseⅡ高效酶催化下生成表達(dá)載體pAd-ZnT1[13]。構(gòu)建過程基于上述位點(diǎn)特異重組不再需要限制性內(nèi)切酶和連接酶的參與，同時(shí)DNA片段的閱讀框和方向保持不變，這種新的表達(dá)更便利、省時(shí)。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建ZnT1不是用來直接進(jìn)行基因治療，而是通過目的基因在真核細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，檢測(cè)BDNF及其受體TrkB的表達(dá)情況，為SCI尋找內(nèi)部自身保護(hù)性因子，從而為SCI的修復(fù)及軸突再生提供理論依據(jù)。

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