喹啉為MFC陽極燃料的微生物群落結(jié)構(gòu)演化分析

張翠萍,謝 健,賈后磊,李明臣,羅 勇,李 婕 (.國家海洋局南海海洋工程勘察與環(huán)境研究院,廣東 廣州 50300；.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 5075)

喹啉是典型的含氮雜環(huán)化合物(NHAs)中典型的難降解有機(jī)物,廣泛存在于醫(yī)藥、化工以及農(nóng)藥生產(chǎn)所排放的廢水中,具有較大的毒性和致癌、致畸變作用[1-2].微生物燃料電池(MFC)用于污水處理領(lǐng)域已有較多研究[3-5].目前報(bào)道可被MFC利用的有機(jī)物主要為易降解物質(zhì),如葡萄糖、乙酸、乙醇等,采用難降解有機(jī)物為MFC燃料的相關(guān)文獻(xiàn)較少,羅勇等[6]以吲哚為燃料嘗試其在MFC中的降解效率,發(fā)現(xiàn)250mg/L的吲哚完全降解的時(shí)間為6h;Morris等[7]采用單極室MFC降解石油類污染物,陰極獲得的最大功率密度為120mW/m2,對石油類污染物的去除率達(dá)到55%以上; Catal等[8]在以2類呋喃類衍生物和8種酚類化合物作為燃料對MFC的產(chǎn)電性能研究表明,只有5-呋喃不需要電子供體就可以利用MFC進(jìn)行直接產(chǎn)電.

目前為止,已有多位學(xué)者對微生物燃料電池陽極生物膜在產(chǎn)電過程中所起的作用進(jìn)行了研究[9-10].Holmes等[11]的研究發(fā)現(xiàn)利用沉積物和活性污泥產(chǎn)生電流的同時(shí),陽極表面的Deltaproteobacteria菌種得到快速繁殖.反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)、光照以及基質(zhì)的類型等都可以影響到陽極的微生物群落結(jié)構(gòu).生物易降解和生物難降解有機(jī)物為燃料時(shí)的MFC產(chǎn)能差別很大,表現(xiàn)在輸出電壓、最大功率密度、庫侖效率以及微生物群落結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面.研究表明,利用乙酸和丁酸鹽等不易發(fā)酵類物質(zhì)為基質(zhì)時(shí)陽極上的微生物群落結(jié)構(gòu),相對利用葡萄糖和谷氨酸鹽等發(fā)酵類物質(zhì)為基質(zhì)時(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)要簡單[12].喹啉作為單一燃料已被證明可以被微生物所降解并進(jìn)行產(chǎn)電[13-14].目前尚未有學(xué)者對以喹啉為基質(zhì)時(shí)的陽極菌落結(jié)構(gòu)及其菌落變化分析進(jìn)行研究.本文在研究喹啉為燃料時(shí)MFC產(chǎn)電可行性的基礎(chǔ)上,利用PCR-DGGE技術(shù)對不同底物條件下的微生物多樣性進(jìn)行分析比較,研究微生物在 MFC利用喹啉降解產(chǎn)電過程中的作用.

1 材料與方法

1.1 MFC裝置構(gòu)造

實(shí)驗(yàn)采用填料型雙極室 MFC,陽極室和陰極室的總體積均為27cm3(9cm×2cm×1.5cm),陰極和陽極室均填充石墨顆粒,同時(shí)加入帶導(dǎo)線的碳布電極(18cm2,UT70-20, Toray Co., Japan))以收集產(chǎn)生的電流.外電路通過導(dǎo)線與陰陽室內(nèi)的碳布連接構(gòu)成回路.陰陽極室中間用質(zhì)子交換膜(Nafion 212, Dupont Co., USA)隔開,填充石墨顆粒后陰陽極室有效體積均為8mL.陰極采用50mmol/L鐵氰化鉀作為電子受體,外電阻為1000?.陽極液和陰極液經(jīng)恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司,BT1-200)在陰陽室內(nèi)循環(huán)流動(dòng),流速為20mL/min.MFC的輸出電壓由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集并輸出至計(jì)算機(jī),采集頻率為每30s一次.取廣州市獵德污水處理廠A2/O工藝污泥上清液200mL置于陽極室內(nèi)作為MFC的接種源.

1.2 微生物群落的樣品采集

當(dāng)以不同基質(zhì)1000mg/L葡萄糖、500mg/L葡萄糖+500mg/L喹啉、500mg/L喹啉為燃料穩(wěn)定運(yùn)行時(shí),在厭氧箱內(nèi)打開陽極室取部分電極樣品.具體步驟如下:將刀片滅菌;取出 4～5顆石墨顆粒;將取出的石墨顆粒用高純水清洗兩次后放入樣品瓶中;用渦旋震蕩的方式將電極上的細(xì)菌震蕩到水溶液中取得菌懸液(A).

1.3 MFC微生物多樣性測定

MFC陽極電極表面的微生物采用 PCRDGGE測定,具體步驟為:①DNA 提取:采用DNA快速提取試劑盒(MP BIO, IIIKirch, France)對上清液A進(jìn)行抽提,獲得DNA沉淀,溶于50uL TAE中溶解;②PCR 擴(kuò)增:用梯度 PCR 儀進(jìn)行DNA 擴(kuò) 增.采用 V 3-2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和 V 3-3 (5’-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) (Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)進(jìn)行V3區(qū)的擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測;③ D GGE(C.B.S.SCIENTIFIC, Del Mar, CA, USA) 分析;④采用聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%,變性梯度為30%～70%,在 1 ×TAE 緩沖液中進(jìn)行電泳,恒壓 200V,電泳時(shí)間5h,變性膠經(jīng)EB(5μLEB稀釋到100mL 1×TAE)染色 10～15min;⑤ DGGE 目的條帶割膠回收:將優(yōu)勢條帶和特異性條帶切割后用20μL TE溶液溶解,溶解后經(jīng)過12000r/min離心,上清液用來進(jìn)行 P CR擴(kuò)增,引物改為 V 3-1(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 V 3-2(5’-ATTACGCGGCTGCTGG-3’).PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送去瓊脂糖凝膠電泳檢測后送樣測序,將測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中已登記的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)條件下的產(chǎn)電效果分析

MFC以不同基質(zhì)為燃料的產(chǎn)電特性曲線見圖 1.結(jié)果表明,當(dāng)分別以1000mg/L葡萄糖、500mg/L葡萄糖與 500mg/L喹啉的混合溶液和500mg/L喹啉為燃料時(shí),MFC獲得的最大電壓分別為699mV、589mV和157mV.當(dāng)以易降解有機(jī)物葡萄糖為燃料時(shí),MFC獲得的電壓最高,產(chǎn)電周期也較短,為43h.把葡萄糖濃度降低至500mg/L,加入500mg/L喹啉形成混合燃料后,MFC的最高輸出電壓受到抑制導(dǎo)致電壓降低,但是輸出庫倫量明顯增加,產(chǎn)電周期增加至 98h.當(dāng)以500mg/L喹啉為單一燃料后,最大輸出電壓降低至200mV以下.以電壓高于50mV為計(jì)算起點(diǎn),以單一葡萄糖、葡萄糖和喹啉共基質(zhì)和單一喹啉為燃料運(yùn)行時(shí)所獲得的電量分別為:30.3,91.7,17.0C.

圖1 以1000mg/L 葡萄糖、500mg/L葡萄糖和500mg/L喹啉、500mg/L喹啉為燃料時(shí)的產(chǎn)電特性曲線Fig.1 Electricity generation using 1000mg/L glucose,500mg/L glucose +500mg/L quinoline and 500mg/L quinoline as fuels

2.2 微生物群落多樣性分析

圖2 不同基質(zhì)條件下16S rDNA基因序列分析DGGE圖譜Fig.2 DGGE profile analysis of 16S rDNA with different substrates G:1000mg/L葡萄糖;G+Q: 500mg/L葡萄糖+500mg/L喹啉;Q:500mg/L喹啉

本文采用 PCR-DGGE分析技術(shù),初步探討了不同基質(zhì)對 MFC陽極電極微生物群落變化的影響(圖2).DGGE圖譜中的每個(gè)條帶及其亮度表征了一類菌及其在菌落結(jié)構(gòu)中的相對豐度.結(jié)果表明,當(dāng)將基質(zhì)由 1000mg/L的葡萄糖更換為500mg/L葡萄糖+500mg/L喹啉后,電極上的微生物群落的組成和多樣性出現(xiàn)了一定的差異.加入喹啉后,一些新的微生物種群得到了富集(條帶2),已有的微生物種群的相對含量也發(fā)生了改變(條帶7、1、3),即優(yōu)勢種群由菌種7和8改為1、2和3.

當(dāng)將等濃度 500mg/L的葡萄糖和喹啉的混合燃料更換為500mg/L的單一喹啉作燃料后,微生物群落發(fā)生了更為明顯的改變.單一喹啉作燃料后,與共基質(zhì)相比,優(yōu)勢菌由2和3變?yōu)闂l帶5和6所示的菌種,新增條帶4所示的菌種為單一喹啉作為燃料特有的優(yōu)勢菌.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同基質(zhì)條件下的微生物群落系統(tǒng)隨之發(fā)生演變.喹啉和葡萄糖共基質(zhì)與喹啉單一基質(zhì)相比微生物群落發(fā)生明顯變化.

2.3 微生物菌種鑒定分析

通過對各樣品優(yōu)勢菌條帶的16S rDNA的基因序列分析,并與Genbank數(shù)據(jù)庫中的已有序列做對比分析,對本試驗(yàn)中的主要優(yōu)勢菌進(jìn)行了鑒定分析,結(jié)果如表1所示.通過將各菌株的基因序列提交至Genbank的NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得的基因序列編號依次為:HM357795—HM357799和HM357801.

綜合DGGE圖譜和序列對比分析,不同基質(zhì)條件下的優(yōu)勢菌不同.

葡萄糖為基質(zhì)時(shí)電極上的生物膜的微生物優(yōu)勢菌(條帶3)與 Uncultured Thauera sp. clone REG R2P1 D4的同源性為97%.以葡萄糖+喹啉共基質(zhì)時(shí)的電極上的微生物優(yōu)勢菌(條帶2)與Pantoea agglomerans clone B10的同源性為100%,另外一種優(yōu)勢菌(條帶3)與 Uncultured Thauera sp. clone REG R2P1 B4的同源性為97%,與葡萄糖共有同一類菌.據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫描述,該類菌也是在以喹啉培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)的.當(dāng)以純喹啉為燃料時(shí),優(yōu)勢菌發(fā)生了明顯的改變,電極上的優(yōu)勢菌(條帶5)與 Uncultured bacterium isolate DGGE gel band 4的同源性為100%,另外一種優(yōu)勢菌(條帶6)與 Uncultured bacterium clone 23a1016S ribosomal RNA gene 和Raoultella ornithinolytica strain DS44的形似度也為100%.而有一種優(yōu)勢菌(4)與Pseudomonas sp.DIC5RS的序列同源性為100%,極有可能為假單胞菌.菌種1也是在MFC中發(fā)現(xiàn)的,與Uncultured bacterium clone MFC-GIST19的同源性為100%.與Genbank數(shù)據(jù)庫的基因序列對比分析得出,本實(shí)驗(yàn)分析的六類菌,有三類是已經(jīng)在 MFC中被發(fā)現(xiàn)的(條帶號為1,5和6),有一類菌(條帶2)與描述中記載的相同,都是由喹啉培養(yǎng)的菌種.雖然無法通過16S rDNA基因序列分析得出每種菌在物質(zhì)的特定代謝功能,但是仍然可以利用這些序列推測分析微生物群落演變過程中的可能所起的代謝功能[15].菌種(條帶4)是一類假單胞菌,是更換為單一喹啉為基質(zhì)后新產(chǎn)生的菌種,這類菌可能是在無添加碳源的條件降解喹啉的過程中起到關(guān)鍵的作用.純菌鑒定結(jié)果同樣得出,從以純喹啉為燃料運(yùn)行的MFC反應(yīng)器中分離篩選出的產(chǎn)電菌株也為假單胞菌.由此推測,假單胞菌是喹啉為燃料的MFC反應(yīng)器中較為豐富的菌種.

表1 不同基質(zhì)條件下陽極微生物群落的16S rDNA的判定分析Table 1 Characterization of isolated 16S rDNA gene fragments derived from the electrodes of the MFCs with different substrates

3 結(jié)論

3.1 不同基質(zhì)條件下的MFC陽極電極上的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變.由 PCR-DGGE圖譜序列與 Genbank數(shù)據(jù)中的基因序列進(jìn)行比對分析,其中有三類菌在MFC中有報(bào)道.

3.2 與葡萄糖共基質(zhì)相比,以單一喹啉為燃料時(shí)的陽極微生物優(yōu)勢菌落發(fā)生明顯改變.新增加一類菌,這類菌與Pseudomonas sp. DIC5RS 的同源性為100%,推測該菌在單一喹啉為MFC燃料時(shí)喹啉的降解過程中起到關(guān)鍵作用.

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