半夏中一種抗癌蛋白的純化及其抗癌活性研究

范漢東，王雪，蔡永君，郭建軍，楊一兵，鄒國林

(1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌，330029；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢，430072；3.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢，430062)

半夏是一種天南星科多年生草本植物，作為已在臨床使用兩千多年的傳統(tǒng)中藥，具有能降逆止嘔、燥濕化痰、和胃安神、消腫排膿等功效.生半夏有毒，須炮制后使用，且現(xiàn)代藥理學(xué)實驗也證明半夏具有鎮(zhèn)咳、祛痰、止吐、鎮(zhèn)靜催眠等作用[1].

由于臨床發(fā)現(xiàn)鮮半夏漿液在治療宮頸癌上有很好的療效，對半夏抗腫瘤有效成分的研究引起很多研究者的興趣[2].近年來的研究表明半夏總蛋白具有抗腫瘤作用.孫光星等發(fā)現(xiàn)半夏的總蛋白能抑制卵巢癌細(xì)胞，且對人臍帶血干細(xì)胞卻沒有明顯的毒副作用[3-4].付蕓等發(fā)現(xiàn)半夏蛋白中30%硫酸銨沉淀部分對Bel-7402細(xì)胞生長具有明顯抑制作用[5].但是，這些研究者都只是研究半夏總蛋白或其中部分組分的抗癌活性，對于這些組分中到底是哪一個或幾個蛋白有抗癌作用依然未知，因此，為進(jìn)一步尋找其有效成分，減少其他無效成分的副作用，促進(jìn)半夏在抗癌中的應(yīng)用，本研究擬從新鮮半夏總蛋白中分離純化具有抗腫瘤活性的蛋白，并用Sarcoma 180作為模型細(xì)胞系研究其抗腫瘤作用，同時用MTT(噻唑蘭)實驗與載瘤小鼠實驗評價APPT 抗腫瘤效果，用流式細(xì)胞儀研究其抗腫瘤的活性.

1 材料與方法

1.1材料鮮半夏(Pinelliaternata)采自湖北荊門并經(jīng)湖北省中醫(yī)藥大學(xué)陳克力教授鑒定；環(huán)磷酰胺購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院；PHE Sepharose Cl-4B與DEAE Sepharose Fast Flow購自法瑪西亞公司 (Pharmasia，Sweden)；MTT購自Sino-American Biotechnology 公司；RPMI 1640購自HyClone (USA)；小鼠購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，同時動物實驗也在該中心完成；Sarcoma 180細(xì)胞系購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心，其他試劑均為分析純.

1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、分光光度計及蛋白質(zhì)譜儀均為美國熱電公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為貝克曼公司產(chǎn)品.

1.3蛋白純化純化過程共分為3步.第一步：將100 g半夏鮮塊莖勻漿，漿液以8 000 r/min離心40 min，取上清，加入硫酸銨直到飽和度為40%，冰箱靜置過夜，再以8 000 r/min離心40 min，取沉淀并用Tris-HCl 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)溶解，將可溶部分裝入透析袋中透析，透析液為含1.5 mol/L硫酸胺的 Tris-HCl 緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)，以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行；第二步—疏水層析：將裝有PHE Sepharose Cl-4B的層析柱(Φ25 mm×L160 mm)先用含1.5 mol/L硫酸胺的 Tris-HCl 緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)平衡，然后將第一步中經(jīng)透析的蛋白上樣，用含硫酸銨的Tris-HCl 緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)梯度洗脫，其中硫酸銨的濃度梯度由0 mol/L到1.5 mol/L，280 nm 監(jiān)測蛋白吸收值.跟蹤檢測并收集活性部分，再用Tris-HCl 緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4)進(jìn)行透析，最后用超濾的方法離心濃縮到合適體積；第三步―陰離子交換柱層析：先將裝有DEAE-Sepharose Fast Flow 的層析柱 (Φ25 mm×L160 mm)用20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 緩沖液進(jìn)行預(yù)平衡，取第二步中濃縮的樣品上樣，用含NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，其中NaCl的濃度梯度為0 mol/L到0.3 mol/L.收集活性部分，用雙蒸水透析除鹽并用超濾法離心濃縮.用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度[6-7]，用12% SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)組分及純度[8]，同時用蛋白質(zhì)譜儀測定蛋白質(zhì)分子量.

1.4中性糖測定以葡萄糖為參照，用苯-硫酸法測定中性糖含量，具體方法參照Malzberg等[9].

1.5MTT實驗MTT實驗方法基本參照Chen Wei等[10-11]，其中Sarcoma 180細(xì)胞培養(yǎng)條件為：含10%小牛血清、100 mg/L 鏈霉素以及100 mU/L青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基、37 ℃及5% CO2.細(xì)胞接種量為1×105，細(xì)胞先在96孔板中培養(yǎng)36 h，然后分別加入磷酸緩沖液(PBS)，終濃度為11、22、33、44和55 μg/mL的APPT，其中PBS做陽性對照，每個濃度重復(fù)4次.分別再培養(yǎng)24 h后分別于每個樣品中加入MTT (5 mg/mL) 并且再培養(yǎng)4 h，然后加入100 μL DMSO終止反應(yīng)，于490 nm下測定吸收值.

1.6流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期實驗實驗中細(xì)胞培養(yǎng)與APPT 處理的方法與MTT實驗相同，基本方法參照Chen Wei等[10]，在用不同濃度的APPT處理12 h或24 h后，離心收集細(xì)胞并用冷的PBS洗兩次，然后用75%酒精重懸，-20 ℃冰箱固定過夜，固定過的細(xì)胞600 r/min離心回收，再用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，然后用溶于PBS的100 μg/mL RNase A在37 ℃處理1 h，最后避光4 ℃冰箱PI (20 μg/mL)處理30 min，最后上機(jī)測定.

1.7載瘤小鼠實驗實驗中所用小鼠為ICR鼠，選擇60只體重在20～22 g雄性昆明ICR鼠，隨機(jī)分成5組，每組12只，ICR鼠在無菌室中養(yǎng)殖3 d后于每只鼠的左側(cè)前腿腋部接種Sarcoma 180細(xì)胞[12]，接種量為每只小鼠接種細(xì)胞密度約為2.5×106cells/mL用PBS溶解的細(xì)胞懸液0.2 mL[10].24 h后，對陰性對照組每兩天注射0.2 mL PBS，陽性對照組每天按20 mg/kg注射環(huán)磷酰胺，實驗組分別按3.25、2.30及0.85 mg/kg 體重的量注射APPT.在第11天處死小鼠，手術(shù)分離腫瘤與脾臟并對其稱重.

抑制率的計算方法為：抑制率/% =[(C-T)/C]×100，其中C為陰性組的腫瘤平均質(zhì)量，T是實驗室中各APPT處理組及陽性對照組的腫瘤平均質(zhì)量[13].器官系數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量.

2 結(jié)果

2.1APPT的純化與分子量的測定聯(lián)合疏水層析與陰離子交換層析從半夏中純化一種具有抗腫瘤選用100 g新鮮的半夏塊莖，凝集素活性的測定方法參照1.3.

表1 半夏塊莖凝集素活性的測定

活性的蛋白，各步采用MTT實驗跟蹤檢測其活性組分并對其進(jìn)行收集透析等處理，各步回收產(chǎn)率見表1，最后的蛋白用SDS-PAGE檢測為一條帶，說明APPT 達(dá)到電泳純，結(jié)果見圖1A.經(jīng)蛋白飛行質(zhì)譜測定APPT的分子量大小為12.09 ku，結(jié)果見圖1B.

圖1 A:SDS-PAGE結(jié)果；B:蛋白飛行質(zhì)譜測定APPT 的分子量

2.2中性糖測定中性糖測定實驗結(jié)果表明APPT是一種糖蛋白，其含糖量為3.22%.

圖2 MTT實驗結(jié)果

2.3MTT實驗MTT實驗主要測定的是胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶失活的死亡的細(xì)胞，胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶沒有失活的細(xì)胞,如活細(xì)胞或者凋亡早期與中期的細(xì)胞就不能被測定，也就是說MTT實驗?zāi)軠y定藥物對細(xì)胞的毒性，反映的是藥物對細(xì)胞增殖的影響以及藥物處理后死亡細(xì)胞的相對量，在我們的實驗中11、22、33、44和55 μg/mL的抑制率分別是14.6%、19.5%、22.1%、29.8%與39%.這一結(jié)果表明，APPT對細(xì)胞有一定的毒性，并且抑制率隨著濃度的增加而增大.

2.4APPT對載瘤小鼠中腫瘤生長的抑制動物實驗表明，APPT與陰性對照相比能明顯抑制載瘤小鼠中腫瘤細(xì)胞的生長，APPT處理的實驗組腫瘤的平均質(zhì)量要比陰性對照組的輕，當(dāng)APPT處理劑量為0.85、2.30及3.25 mg/kg體重時，其抑制率分別為15.6%，32.1%，36.2%；但與陽性對照組相比，APPT處理的實驗組腫瘤的平均質(zhì)量要略高于陽性對照組的，結(jié)果見表2.

表2 APPT對載瘤小鼠中腫瘤生長的影響

抑制率=(陰性對照鼠的腫瘤質(zhì)量-實驗小鼠腫瘤質(zhì)量)/陰性對照鼠的腫瘤質(zhì)量×100%；脾指數(shù)=脾重/體質(zhì)量(mg/g).

2.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期MTT實驗結(jié)果表明APPT體外對Sarcoma 180細(xì)胞有一定毒性，同時在載瘤小鼠實驗中卻能明顯抑制載瘤小鼠腫瘤的生長，為進(jìn)一步闡明APPT是影響細(xì)胞的分裂還是直接殺死細(xì)胞，我們用流式細(xì)胞儀分析APPT對Sarcoma 180細(xì)胞周期的影響，結(jié)果見圖3，從圖中可以看出：無論處理時間為12 h還是處理時間為24 h，不同濃度的APPT 均能使細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比率減少，而且隨著處理時間延長和處理濃度的增加這一趨勢更加明顯，特別在 20和 40 μg/mL的 APPT處理24 h后S期細(xì)胞的比率極低，在所有實驗中均沒有觀察到凋亡峰.綜合這些結(jié)果表明APPT 通過抑制細(xì)胞分裂中的DNA合成起始從而影響細(xì)胞增殖以達(dá)到抑制腫瘤生長的目的.

圖3 APPT對Sarcoma 180細(xì)胞周期的影響

3 討論

半夏是一種傳統(tǒng)的中藥，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)鮮半夏的汁液可以用于治療宮頸癌，因此被廣大的研究者所重視，在以前的研究中發(fā)現(xiàn)半夏的總蛋白與30%的硫酸胺組分都有抑癌活性，但沒有對具體的成分進(jìn)一步分離純化，然而鮮半夏有較強(qiáng)的刺激性，因此有必要進(jìn)一步深入分離純化其抗癌的有效成分，以減少非抗癌活性組分可能引起的副作用[3-5].本研究中選擇Sarcoma 180作為模型細(xì)胞系研究APPT抗腫瘤能力是因為Sarcoma 180是廣泛使用并被認(rèn)可的可用于篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞系[14]，APPT 能明顯抑制載瘤小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長，且濃度越大，抑制率越高，這與MTT實驗結(jié)果相一致.MTT實驗主要測定的是胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶失活的死亡的細(xì)胞，胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶沒有失活的細(xì)胞,如活細(xì)胞或者凋亡早期與中期的細(xì)胞就不能被測定，也就是說MTT實驗?zāi)軠y定藥物對細(xì)胞的毒性，反映的是藥物對細(xì)胞增殖的影響、藥物處理后死亡細(xì)胞的相對量以及凋亡晚期的細(xì)胞，為進(jìn)一步闡明APPT對Sarcoma 180的抑制的機(jī)制是通過誘導(dǎo)凋亡的方式還是通過抑制其分裂增值的方式，我們用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步測定APPT對細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)APPT處理的細(xì)胞中沒有出現(xiàn)凋亡峰，但大量細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，提示APPT能抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制起始進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂增殖，表明APPT抑癌的機(jī)理并不是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而是抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖.以前的一些研究結(jié)果也表明有部分物質(zhì)對腫瘤的抑制作用同APPT一樣是通過抑制細(xì)胞增殖而不是直接誘導(dǎo)其凋亡[15-16].綜上所述，APPT是半夏總蛋白中抑制腫瘤的有效成分之一，這一研究對于進(jìn)一步提取鮮半夏中抗腫瘤有效成分，降低在使用過程中其他無效成分對機(jī)體的刺激或其他副作用有重要的意義.

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