遺傳校正β－地中海貧血患者特異性iPSCs的功能探討

周 林 鄭陳光 楊 澤

β－地中海貧血是一種十分常見的遺傳性血細(xì)胞紊亂性疾病，它以β珠蛋白合成減少為特征，影響轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯的HBB基因的點(diǎn)突變或微小缺失是其常見的分子缺陷。重型β地中海貧血，又稱Cooley’s貧血，患者多表現(xiàn)為重度貧血及肝脾腫大。如果不進(jìn)行治療，將會影響患者的生長發(fā)育，嚴(yán)重者可危及其生命。在中國，β－地中海貧血多發(fā)于廣東、廣西和海南一帶，嚴(yán)重威脅著該地區(qū)數(shù)百萬人的生命健康。然而，目前還沒有有效的治療措施。

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過超表達(dá)分化型體細(xì)胞的幾個轉(zhuǎn)錄因子可以獲得誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPSCs)，而這些細(xì)胞具有治愈多種遺傳性及退行性疾病的潛能［1，2］。Hanna J等研究發(fā)現(xiàn)，患有人源化鏈狀細(xì)胞性貧血的模型鼠，通過移植已進(jìn)行靶基因遺傳校正的iPSCs，可以產(chǎn)生造血干細(xì)胞進(jìn)而得到治愈［3］。

目前，本課題組已由一個2歲的β－41/42純合子的地中海貧血患者的皮膚組織切片中獲得了纖維母細(xì)胞，成功地構(gòu)建了患者特異性iPS細(xì)胞并對其基因變異完成遺傳校正。本研究旨在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，將遺傳校正的iPSCs移植入SCID小鼠中，探討其在SCID小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。該結(jié)果將對未來β－地中海貧血的個體化治療的研究提供重要的理論依據(jù)。

1.方法

1.1 SCID小鼠脛骨內(nèi)移植 將8～10周的體重相同的雌性免疫缺陷SCID小鼠隨機(jī)分成4組:α－MEM組、piPSHP組、ciPS－HP組與hES－HP組，對其進(jìn)行6小時(shí)的Co－60照射。同時(shí)，收集5×105派生于piPSCs、ciPSC和hESCs的CD34+定向造血祖細(xì)胞，經(jīng)MACS濃縮后，在IMDM培養(yǎng)基中懸浮，然后轉(zhuǎn)入一個28 G的胰島素注射器內(nèi)。移植時(shí)，將注射器針頭垂直插入小鼠脛骨并輕輕轉(zhuǎn)動，使其管內(nèi)的懸浮細(xì)胞注入脛骨內(nèi)，完成對SCID小鼠的脛骨內(nèi)注射移植。

1.2 移植后iPS細(xì)胞的功能檢測 移植6周后，收集外周血、移植和非移植的骨髓細(xì)胞或脾細(xì)胞，進(jìn)行一下檢測:①使用特異性人類HLAABC抗體和人類CD71抗體進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，檢測SCID的移植細(xì)胞的紅細(xì)胞生成能力;②采用western blot技術(shù)分析其β－珠蛋白和γ－珠蛋白的表達(dá)情況。

2.結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞生成能力檢測 移植6周后，收集SCID小鼠外周血、移植與非移植的骨髓細(xì)胞和脾血細(xì)胞，使用特異性人類HLAABC抗體和人類CD71抗體分別進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，檢測遺傳校正的iPS細(xì)胞在SCID移植鼠中的紅細(xì)胞生成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn):除注射有α－MEM的正常對照小鼠外，其他三組小鼠的外周血及骨髓細(xì)胞中均可以檢測到相同比率的HLA－ABC+細(xì)胞，骨髓細(xì)胞及脾血細(xì)胞中可以檢測到相同比率的早幼紅細(xì)胞。這些研究結(jié)果顯示移植入SCID小鼠體內(nèi)的iPS細(xì)胞具有生成紅細(xì)胞的功能。

2.2 β－珠蛋白與γ－珠蛋白的表達(dá)情況 分別收集4組移植鼠的外周血，采用western blot技術(shù)分析其β－珠蛋白與γ－珠蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:ciPSC－HP組小鼠β－珠蛋白的表達(dá)水平低于hESC－HP組的，其β－珠蛋白的表達(dá)水平僅是 hESC－HP組的一半，而α－MEM組和piPSCHP組小鼠的外周血中均未檢測到人類β－珠蛋白的表達(dá);除α－MEM組外，在其他三組中均可以檢測到γ－珠蛋白的表達(dá)。hESC－HP、piPSC－HP與ciPSC－HP組的γ－珠蛋白的表達(dá)水平相似。這些研究結(jié)果表明:遺傳校正的iPSCs在體內(nèi)經(jīng)定向造血干細(xì)胞分化后可以同hESCs一樣，可以產(chǎn)生人類β－珠蛋白與γ－珠蛋白(見圖1)。

圖1 β－珠蛋白和γ－珠蛋白在移植后的SCID小鼠外周血中的表達(dá)情況

3.討論

在本研究中，我們將將β－地中海貧血患者特異性iPS細(xì)胞的基因變異進(jìn)行遺傳校正后，移植入免疫缺陷SCID小鼠中，檢測移植入SCID小鼠的iPS細(xì)胞的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn):移植入SCID小鼠體內(nèi)的iPS細(xì)胞具有生成紅細(xì)胞能力，可以提高SCID小鼠的紅細(xì)胞生成量，還可以產(chǎn)生人類特異性β－珠蛋白與γ－珠蛋白。這一研究結(jié)果為iPSC應(yīng)用于臨床治療重癥β地中海貧血提供了新的理論依據(jù)。

校正患者特異性iPS細(xì)胞的遺傳變異是實(shí)現(xiàn)個體化再生醫(yī)學(xué)的至關(guān)重要的一步。我們的研究結(jié)果初步證明，遺傳校正的iPS細(xì)胞在移植入免疫缺陷SCID小鼠中后，可以在SCID小鼠體內(nèi)發(fā)揮其生成紅細(xì)胞和合成β－珠蛋白與γ－珠蛋白的生物學(xué)功能，在一定程度上達(dá)到治療β－地中海貧血的效果，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

然而，在實(shí)現(xiàn)iPSCs應(yīng)用于臨床治療β－地中海貧血之前，還有大量的問題亟需我們解決，還有重重困難需要克服。首先，獲得高質(zhì)量的iPS細(xì)胞是將來進(jìn)行進(jìn)一步的基因操作的重要前提。最新的蛋白質(zhì)、mRNA和micro RNA改造iPS細(xì)胞技術(shù)，為獲得更為有效的患者特異性iPS細(xì)胞提供了較為理想的方法［4～6］。另外，還需要進(jìn)一步優(yōu)化校正后的iPS細(xì)胞定向分化為特異細(xì)胞類型的方法。最近的研究發(fā)現(xiàn)，不論是在體內(nèi)還是體外，細(xì)胞可以由一種類型轉(zhuǎn)換為另一種類型。然而，目前還不知道這些轉(zhuǎn)換后的細(xì)胞是否具有分化功能，因?yàn)檫@些細(xì)胞的端粒長度可能不會得到適當(dāng)?shù)男迯?fù)［7］。值得注意的是，在iPSCs中，端粒的長度可以得到修復(fù)［8，9］。總之，我們的研究為iPSC技術(shù)結(jié)合基因靶向作用，應(yīng)用于臨床治愈遺傳性疾病如重癥β地中海貧血的潛在性，提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

4.結(jié)論

我們的研究結(jié)果顯示:將遺傳校正的iPSCs移植入SCID小鼠體內(nèi)后，將會提高定向造血干細(xì)胞生成正常紅細(xì)胞的能力，并且還可以產(chǎn)生人類β－珠蛋白與γ－珠蛋白。該研究結(jié)果為“iPSCs可用于臨床治療β－地中海貧血”這一設(shè)想提供了理論依據(jù)，為治愈遺傳變異性血液病帶來了希望。

1 Park IH，Zhao R，West JA，et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors［J］.Nature，2008，451:141－146.

2 Yu J，Vodyanik MA，Smuga－Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318:1917－1920.

3 Hanna J，Wernig M，Markoulaki S，et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin［J］.Science，2007，318:1920－1923.

4 Warren L，Manos PD，Ahfeldt T，et al.Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］.Cell Stem Cell，2010，7:618 －630.

5 Miyoshi N，Ishii H，Nagano H，et al.Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs［J］.Cell Stem Cell，2011，8:633 －638.

6 Kim D，Kim CH，Moon JI，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4:472 －476.

7 Szabo E，Rampalli S，Risueno RM，et al.Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors［J］.Nature，2010，468:521－526.

8 Agarwal S，Loh YH，McLoughlin EM，et al.Telomere elongation in induced pluripotent stem cells from dyskeratosis congenita patients［J］.Nature，2010，464:292－296.

9 Marion RM，Strati K，Li H，et al.Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2009，4:141 －154.