乳酸脫氫酶在CTAB-戊醇反膠束體系中的催化動力學(xué)研究

柳暢先，胡亞楠，馬 璐

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,武漢 430074)

反膠束體系是一種類生命環(huán)境介質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物物質(zhì)活性控制方面[1]，它作為酶反應(yīng)介質(zhì)，對酶有保護(hù)作用[2-4]，近年來各國學(xué)者深入研究反膠束中酶的固定化、動力學(xué)特征和穩(wěn)定性等方面[5-7]，拓寬了反膠束技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域[8,9].Kamyshny等[10]發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶在反膠束溶液中的酶活力和穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于水溶液，且活力決定于含水量.Hirakawa等[11]發(fā)現(xiàn)AOT/異辛烷體系可增加酵母醇脫氫酶和羥類固醇脫氫酶的穩(wěn)定性，延長輔酶的再生使用壽命，使輔酶循環(huán)再生，總轉(zhuǎn)化率是水溶液中的7倍.

基于反膠束酶體系在以上領(lǐng)域研究較多，而在分析測定方面應(yīng)用較少，本課題組從酶法測定的角度研究反膠束溶液中的酶催化反應(yīng)，針對乳酸脫氫酶(LDH)在十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)-辛烷-己醇體系中酶的固載量和靈敏度不足[12]，以CTAB-異辛烷-戊醇體系固定化乳酸脫氫酶LDH，探討含水量、CTAB濃度和戊醇體積比對LDH進(jìn)入反膠束的影響，比較反膠束固定化酶和游離酶的催化性質(zhì)，找出適用于酶法測定的條件.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-1100型分光光度計(北京瑞利分析儀器公司),FA2400分析天平(上海精科天平廠)，PHS-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠)，CS2501型超級恒溫水浴槽(武漢實驗儀器廠).

乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(9.51mol/L,經(jīng)標(biāo)定)，CTAB、辛烷、異辛烷、戊醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl-水合肼緩沖溶液(0.05mol/L)，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，武漢生命技術(shù)公司)，LDH(Sigma).

1.2 實驗方法

稱取一定質(zhì)量的CTAB，加入戊醇和異辛烷共4mL，邊振蕩邊加入LDH和一定pH的緩沖液，形成均一透明的反膠束固定化LDH體系.

于比色皿中加入3.0mL Tris-HCl-水合肼緩沖液和一定量的游離LDH，或3.0mL反膠束溶液，以0.05mol/L NAD引發(fā)反應(yīng)，測定ΔA340，計算酶活力和相對酶活力.v=ΔA×V/ (Δt×ε×b)，式中v為酶促反應(yīng)速度(酶活力,μmol/min)， ΔA為吸光度變化值，V為反應(yīng)液體積(mL)，Δt為時間變化值(min)，ε為摩爾吸收系數(shù)(L/(mmol·cm))，b為光程(cm).相對酶活力(Relative activity) = (酶活力/酶活力最大值)×100%.

米氏常數(shù)(Km)=[S](Vmax/v―1)，v為酶促反應(yīng)速度，Vmax為最大酶促反應(yīng)速度，[S]為底物濃度.(Km值等于Lieweaver-Burk曲線與橫坐標(biāo)交點的倒數(shù)).

2 結(jié)果與討論

2.1 含水量、CTAB濃度和戊醇濃度對酶固定化的影響

體系中含水量、CTAB濃度和戊醇濃度對酶固定化的影響見圖1.其中含水量W0(W0=n(water)/n(CTAB))是反膠束體系的一個重要參數(shù)，其值決定了反膠束水池的尺寸.反膠束水池性質(zhì)隨W0變化且導(dǎo)致酶活變化.由圖1a可見，酶活力隨含水量變化呈先上升后下降的曲線.當(dāng)W0值較小時，沒有形成清晰透明的反膠束；當(dāng)W0值為4.3時，酶活力達(dá)到最大值；而W0繼續(xù)增大酶活力反而下降，W0到6時反膠束體系變渾濁.由圖1b可見，隨著CTAB濃度的增加，LDH活力逐漸增加，當(dāng)CTAB濃度為0.24mol/L時酶活力達(dá)到最大；隨后LDH活力逐漸下降，說明CTAB含量過高對反膠束的形成有影響.由圖1c可見，戊醇體積比小于10%時不能形成清晰透明的反膠束，隨著戊醇體積比的增加，反膠束中LDH活力增加，但超過25%時，酶活力逐漸下降，戊醇最佳體積比為25%.

a) 含水量；b) CTAB濃度；c) 戊醇體積比

2.2 酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 pH值和溫度對酶活力的影響

在不同pH值的水溶液和反膠束溶液中分別測定游離酶和固定化酶活力，由于反應(yīng)介質(zhì)會影響活性部位中主要基團(tuán)、酶-底物復(fù)合物和底物的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶活力的變化范圍，pH值會影響酶活力，結(jié)果見圖1a.如圖1a所示，游離酶和固定化酶動力學(xué)反應(yīng)的最適pH值均為8.8.從pH曲線的陡緩程度可看出，游離酶對pH的變化較固定化酶更為敏感，說明酶經(jīng)固定化之后更能適應(yīng)溶液酸堿度的變化.

溫度升高使酶活力增大，但溫度過高時，酶蛋白的熱變性導(dǎo)致酶逐漸喪失活力.在12～60℃測定了溫度對游離酶和固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖1b.由圖1b可見，游離酶和固定化酶隨溫度變化的趨勢相似，但范圍不同，最適反應(yīng)溫度分別為52℃和30℃.

2.2.2 米氏常數(shù)的測定

米氏常數(shù)(Km)值表示酶對底物親和力的大小，是酶的特征常數(shù).以乳酸為底物測出游離酶和固定化酶的Km分別為65mmol/L和48mmol/L，結(jié)果見圖3.比較游離酶和固定化酶的直線，發(fā)現(xiàn)固定化后Km減小，說明酶和底物的親和力增加.

a) pH值；b) 溫度

1) 游離酶；2)固定化酶

2.2.3 LDH的活力穩(wěn)定性

在25℃及最佳介質(zhì)條件下測定了游離酶和固定化酶的活力穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4.由圖4可見，放置2 h后固定化酶活力損失16%，游離酶損失35%，說明LDH在反膠束體系中更穩(wěn)定，反膠束可模擬酶的天然環(huán)境，較好地保持酶活性.

1) 游離酶；2) 固定化酶

2.2.4 LDH的熒光光譜

固定化酶和游離酶的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜相比有較大不同，由圖5可見，游離LDH的激發(fā)和發(fā)射波長分別為290nm和343nm，而固定化LDH的激發(fā)和發(fā)射波長分別藍(lán)移了29nm和34nm，表明反膠束中酶分子的構(gòu)象發(fā)生了改變.

1) 固定化酶,激發(fā)光譜,λmax=261nm；2) 游離酶,激發(fā)光譜,λmax=290nm；3) 固定化酶,發(fā)射光譜,λmax=309nm；4) 游離酶,發(fā)射光譜,λmax=343nm

3 結(jié)論

LDH進(jìn)入反膠束的最佳條件為：W0=4.3，c(CTAB)=0.24mol/L，φ(pentanol)=25%.游離酶和固定化酶酶促反應(yīng)的最適pH值均為8.8，最適反應(yīng)溫度分別為52℃和30℃，Km分別為65mmol/L和48mmol/L.在25℃時，游離酶存放2 h后失活35%，而固定化酶僅失活16%，說明反膠束固定化酶具有良好的活力穩(wěn)定性.

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