寬體金線蛭鮮品和干品提取物體外抗凝血活性研究

萬(wàn) 明，唐仕歡，游 云，劉義梅，陳科力*

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430065；2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為療效顯著的常用中藥.1986年召開(kāi)的全國(guó)活血化瘀學(xué)術(shù)會(huì)議上，水蛭被確定為35種活血化瘀的中藥材之一，并把水蛭劃為活血作用最顯著的前10種藥之一.2010年版中國(guó)藥典規(guī)定水蛭為水蛭科水蛭Hirudo nipponica Whitman,螞蝗WhitmaniapigraWhitman和柳葉螞蝗W.acranulata Whitman 3種動(dòng)物的干燥體[1]，但據(jù)調(diào)查，目前國(guó)內(nèi)藥材市場(chǎng)上銷(xiāo)售的商品藥材只有寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman一種[2]，絕大多數(shù)地區(qū)臨床上使用的水蛭主要為非吸血類(lèi)且不含水蛭素的寬體金線蛭[3,4].藥理研究表明，水蛭具有抗凝、抗血栓等作用[5]，寬體金線蛭不含有抗凝血活性物質(zhì)水蛭素，但仍然具有抗凝活性.作者發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭的抗凝血藥理活性與其提取方法有關(guān)，其鮮品及干品脫脂后熱提所得提取物具有較好的活性[6].針對(duì)寬體金線蛭鮮品和干品的2種提取物，本文做了進(jìn)一步的體外藥理實(shí)驗(yàn)，報(bào)告如下.

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

普利生血凝儀，C2000-4；血流變測(cè)試儀，SA-5000.

1.2 藥物的配制

水蛭藥材(寬體金線蛭WhitmaniapigraWhitman)購(gòu)于湖北中盛水蛭生物科技有限公司，物種經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定.鮮品以100 g為最小單位分裝，直接放置于-70 ℃中冷凍保存；干品則用鮮品洗凈后吊干(稱(chēng)清水貨)，冷藏或-18 ℃以上保存.

4#水蛭(干品)提取物：取寬體金線蛭干品50 g，切薄片，用5倍量體積的石油醚脫脂2次，傾出石油醚后，加入10倍量體積的水，加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾，第2次加入8倍體積的水，加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾，合并兩次提取液，離心，上清液冷凍干燥.

5#水蛭(鮮品)提取物：取冷凍寬體金線蛭鮮品200 g，自然解凍，剪碎，加3倍量生理鹽水，高速分散儀勻漿30 min，加水補(bǔ)齊至10倍量，冰箱放置，浸泡12 h，紗布濾過(guò)，再加3倍量生理鹽水，勻漿30 min，加水補(bǔ)齊至8倍量，冰箱放置，浸泡12 h，紗布濾過(guò)，合并濾液，低速離心，上清液冷凍干燥.

試劑：tris-base(Amersco公司)，血漿纖維蛋白原(FIB)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1320311；血漿部分凝血活酶時(shí)間(APTT)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：111029、血漿凝血酶原時(shí)間(PT)含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：105158.

Tris-Hcl配置：精密稱(chēng)取Tris 12.1g，加80 mL蒸餾水溶解后加入7 mL濃鹽酸，放置到室溫，加鹽酸調(diào)pH 7.4，取5mL該溶液定容到50 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mol/L的溶液，4°C備用.

上述水蛭提取物分別稱(chēng)取400 mg，加Tris-Hcl 4mL溶解超聲振蕩15 min，10000 r/min離心5 min，取上清液，倍比稀釋濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 mg/mL.

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，250±10g，40只.

2 方法和結(jié)果

2.1 血漿的制備

取大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3.8 %枸櫞酸鈉1∶9抗凝，離心取血漿備用.

2.2 分組及給藥

每組平行3份，給藥體積1∶5(30 μL藥液加120 μL血漿)，分組及給藥濃度如表1.

表1 分組及給藥濃度表

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

PT、APTT、FIB及血漿粘度. 檢測(cè)結(jié)果如圖1～9.

圖1 不同濃度5#水蛭提取物對(duì)血漿PT值的影響

圖2 不濃度4#水蛭提取物對(duì)血漿PT值的影響

圖3 同濃度5#水蛭提取物對(duì)血漿APTT值的影響

圖4 同濃度4#水蛭提取物對(duì)血漿APTT值的影響

圖5 FIB標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 不同濃度5#水蛭提取物對(duì)血漿FIB值的影響

圖7 不同濃度4#水蛭提取物對(duì)血漿FIB值的影響

不同提取方法的水蛭提取物對(duì)血漿PT、APTT、FIB均有不同程度的影響.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，5#水蛭鮮品提取物對(duì)PT、APTT、FIB的作用較強(qiáng)，4#水蛭干品提取物作用稍弱， 5#、4#水蛭提取物對(duì)血漿PT、APTT、FIB的影響呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系(分別見(jiàn)圖1、2、3、4、6、7)，即隨著藥物濃度的增高，凝血酶原時(shí)間及部分凝血活酶時(shí)間明顯延長(zhǎng)，血漿纖維蛋白原含量明顯降低.不同提取方法的水蛭提取物對(duì)血漿粘度的影響不明顯(圖8、9).

圖8 不同濃度5#水蛭提取物對(duì)血漿粘度的影響

圖9 同濃度4#水蛭提取物對(duì)血漿粘度的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水蛭(寬體金線蛭)兩種提取物具有明顯的抗凝活性.一方面，水蛭提取物可以延長(zhǎng)大鼠血漿PT和APTT，說(shuō)明其可干擾內(nèi)、外源性凝血因子的活性，而抑制凝血酶原向凝血酶的轉(zhuǎn)化，使纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)變過(guò)程受到抑制；可以明顯降低血漿FIB含量.給藥終濃度為5 mg/mL即顯示出一定的延長(zhǎng)PT、APTT時(shí)間，降低FIB含量的作用.5#提取物延長(zhǎng)PT 50%有效劑量為20.19 mg/mL；延長(zhǎng)APTT 50%有效劑量為16.75 mg/mL；降低FIB 50 %有效劑量為11.8 mg/mL.4#提取物延長(zhǎng)PT 50%有效劑量大約為26.25 mg/mL；降低FIB 50%有效劑量為17.50 mg/mL.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明水蛭5#提取物的抗凝活性強(qiáng)于4#提取物，即鮮品寬體金線蛭的抗凝血活性強(qiáng)于干品，這為目前水蛭的臨床應(yīng)用提倡用鮮品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).我們將在進(jìn)一步的試驗(yàn)中研究寬體金線蛭不同提取物中的抗凝活性物質(zhì).

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:77-78.

[2]蔡少青，李勝華.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究(北方編，第5冊(cè))[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001:600-609.

[3]宋大祥，馮鐘琪.螞蟥[M].北京：科學(xué)出版社，1978.

[4]楊 潼.螞蟥的醫(yī)藥學(xué)意義[J].生物學(xué)通報(bào),1996,31(3)：46.

[5]張希成,李 剛.水蛭的藥理與臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)中藥,2006,3(17):123.

[6]萬(wàn) 明,汪 蜜 ,劉義梅 ,等. 寬體金線蛭抗凝血活性物質(zhì)的提取方法研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(6): 6-8.