2株嗜堿性放線菌的分離鑒定及特性研究

熊 鷹，余金輝，阿不都克里木·熱依木，魏艷紅，李 逸，莫小妍，陳湖星，袁永澤，劉德立＊

（1.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；2.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054）

2株嗜堿性放線菌的分離鑒定及特性研究

熊 鷹1，余金輝1，阿不都克里木·熱依木2，魏艷紅1，李 逸1，莫小妍1，陳湖星1，袁永澤1，劉德立1＊

（1.華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；2.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054）

從新疆巴洲和碩縣堿性土壤中分離純化出2株放線菌菌株XJ－1和XJ－4，對(duì)其形態(tài)特征、生理生化特性、抗生素產(chǎn)生以及16SrRNA基因序列分析等方面進(jìn)行了多種特性研究.結(jié)果表明.2株放線菌在pH7.0的中性條件下不能生長，在pH12.0的強(qiáng)堿性條件下能夠生長，最適生長pH為10.0，屬于嗜堿性放線菌.2株放線菌菌株能耐受10%的NaCl，最高耐受溫度為45℃.菌株XJ－1產(chǎn)生抗生素，能抑制柑橘綠霉菌、水稻輪紋菌、棉花枯萎菌和小麥赤霉菌的生長.16SrRNA基因同源性分析表明XJ－1屬于擬諾卡氏菌屬的Nocardiopsis dassonvillei，序列相似性達(dá)到了99.9%.而XJ－4與Nocardiopsis.sp.AF－333的序列相似性達(dá)到了99.3%，有可能是一新種.

嗜堿性放線菌；分離；鑒定；抗生素

放線菌作為生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌之一早已成為人們研究的焦點(diǎn).嗜堿性放線菌作為極端環(huán)境放線菌的特殊類群，它們形成極為特殊的生理機(jī)制，并產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物，如特殊的酶類（耐熱酶、堿性酶等）及各種有生物活性的物質(zhì)，如抗生素及酶的抑制劑等，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［1-5］.同時(shí)，它們必然具有獨(dú)特的基因類型，在生命進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育等研究中具有重要的理論意義［6-7］.

目前人們所知道的微生物的種類約占實(shí)際總數(shù)的1%～10%，而對(duì)極端環(huán)境下微生物的認(rèn)識(shí)則更加缺乏，目前國際上對(duì)極端環(huán)境放線菌的研究也很少［8］.我國新疆地區(qū)廣泛分布著重鹽堿環(huán)境，這些天然環(huán)境資源為我們研究其中的放線菌提供了得天獨(dú)厚的條件.本研究從我國新疆巴洲和碩縣采集樣品，進(jìn)行了放線菌的分離和篩選，并對(duì)分離到的菌株進(jìn)行了形態(tài)和生理生化、耐堿性和耐鹽性、產(chǎn)特殊抑菌活性物質(zhì)、16SrRNA序列分析等方面的研究，采用多相分類技術(shù)對(duì)其分類地位進(jìn)行了最終確定.

1 材料和方法

1.1 菌株來源

從新疆巴洲和碩縣堿性土壤中采集樣品，適當(dāng)處理后，采用添加50mg／L重鉻酸鉀的HV瓊脂培養(yǎng)基［9］和高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離，30℃培養(yǎng)5～7d，共分離出20多株堿性放線菌菌株，進(jìn)一步篩選出2株嗜堿性菌株，編號(hào)為XJ－1和XJ－4.

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴(kuò)增儀（美國生科公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）、連接儀（美國polyscience）、光學(xué)顯微鏡（Nicon）、pH510臺(tái)式pH 計(jì)（EUTECH）、5415R 小型高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf）；DNA聚合酶、dNTP、pMD18－T載體、EcoR I和 HindⅢ酶（TaKaRa公司）.

1.3 培養(yǎng)基

Bennett培養(yǎng)基：葡萄糖10g，酶解酪素2g，酵母浸膏1g，牛肉膏1g，蒸餾水1 000mL.

高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KNO31.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，NaCl 0.5g，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL.

察氏培養(yǎng)基：NaNO33.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，

蔗糖30g，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL.

燕麥粉酵母膏培養(yǎng)基：燕麥粉20g，酵母浸膏l(xiāng)g，瓊 脂 18g，微量鹽溶液1.0mL，蒸餾水1 000mL.（微量鹽溶液配方：FeSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.1g，ZnSO40.1g，蒸餾水1 000mL）

無機(jī)鹽淀粉瓊脂：淀粉10g，（NH4）2SO42g，K2HPO41g，CaCO33g，NaCl 1g，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL.

馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯塊200g（削皮稱量，水煮30min，然后過濾得清濾液，補(bǔ)足水），蔗糖20g，NaCl 10g，瓊脂18g.

碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM無碳培養(yǎng)基）：KCl 0.2g，（NH4）2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL.

酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（黑色素產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)）：L一酪氨酸l.0g，酵母浸汁1.0g，NaCl 8.5g，瓊脂18g，蒸餾水1 000mL.

黃豆粉浸汁培養(yǎng)基：可溶性淀粉5.0g，蔗糖10.0g，蛋白胨2.0g，酵母膏2.0g，NaCl 10.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO31.0g，瓊脂18g，2%黃豆粉浸汁1 000mL.

以上培養(yǎng)基均調(diào) pH 為 9.0，121℃ 滅菌30min.

1.4 形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察

將放線菌菌株XJ－1和XJ－4接種到燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基和無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH為10），30℃培養(yǎng)14d，觀察其宏觀形態(tài)特征，包括菌落形態(tài)、基絲顏色、氣絲顏色、孢子形狀、孢子鏈特征、有無可溶性色素等.用燕麥片瓊脂培養(yǎng)基埋片培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)21d后取埋片，光學(xué)顯微鏡觀察其微觀形態(tài)特征.

1.5 生理生化特性

按Shirling和Gottlieb［10］等人的方法進(jìn)行生理生化特性研究.觀察并記錄碳源的利用、酶類產(chǎn)生、黑色素產(chǎn)生等特征.

NaCl耐受實(shí)驗(yàn)：ISP5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH為9.0，添加NaCl濃度分別為：0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%.培養(yǎng)基與鹽分別滅菌后充分混勻，倒平板，30℃條件下培養(yǎng)21d.每3～5d觀察記錄，重復(fù)2次［10］.

溫度耐受實(shí)驗(yàn)：高氏一號(hào)瓊脂作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)pH為9.0.不同溫度條件下培養(yǎng)30d，每2～3d觀察記錄，重復(fù)2次.

pH耐受實(shí)驗(yàn)：ISP5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH分別為 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0.30℃條件下培養(yǎng)21d，每1～2d觀察并記錄，重復(fù)4次.

1.6 抗生素測(cè)定

1.6.1 供試菌 棉花枯萎菌（Fusariumoxysporum），水稻紋枯菌（Rhizoctonia solani），小麥赤霉病菌（Fusarium raminearum），蘋果輪紋菌（Macrophoma kuwatsukai），柑橘綠霉菌（Penicillium digitatum），玉米黑粉菌（Ustilago maydis）.

1.6.2 放線菌產(chǎn)生的特殊抑菌活性物質(zhì)的測(cè)定

采用瓊脂塊法［11］對(duì)放線菌產(chǎn)生的特殊抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定.將放線菌菌株接種在黃豆粉浸汁瓊脂培養(yǎng)基平板上涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)7d.用打孔器（直徑8.0mm）在皿內(nèi)菌落生長均勻的地方打孔，制備瓊脂塊以備用.將供試菌（棉花枯萎菌、水稻紋枯菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋菌、柑橘綠霉菌和玉米黑粉菌）懸液涂布于PDA平板上備用.然后將制備好的瓊脂塊用無菌鑷子挑出，反面放置于制備好的供試菌PDA平板上，放置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小，進(jìn)行結(jié)果記錄.用抑菌圈直徑大小表示放線菌對(duì)病原菌拮抗作用的強(qiáng)弱.

1.6.3 抑制菌絲生長速率測(cè)定 對(duì)有抑制圈的菌株采用抑制菌絲生長速率法［12-13］進(jìn)一步測(cè)定對(duì)于菌絲的抑制作用.黃豆粉浸汁培養(yǎng)基液體發(fā)酵有抗性菌株放線菌，取培養(yǎng)7d的發(fā)酵液1mL和9mLPDA混勻倒平板，制成帶毒培養(yǎng)基，以蒸餾水代替發(fā)酵液為對(duì)照.用直徑為8.0mm的打孔器在培養(yǎng)好的供試菌菌落邊緣切下菌餅反接于帶毒培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用下列公式計(jì)算菌絲生長抑制率：

1.7 16SrRNA基因序列確定與分析

1.7.1 總DNA的提取及16SrRNA基因擴(kuò)增總DNA的提取參考Kutchma A.J的方法［14］并加以改進(jìn).16SrRNA基因的擴(kuò)增與克隆參照分子克隆手冊(cè)進(jìn)行.PCR擴(kuò)增采用以下引物：P1∶5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；P2∶5’GGTTACCTTGTTA CGACTT3’.反應(yīng)條件為：95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸31min 30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min.PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.7.2 16SrRNA基因序列測(cè)定及分析 利用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD18－T進(jìn)行連接，反應(yīng)體系為10μL（T載體1μL，PCR產(chǎn)物5μL，連接緩沖液4μL），16℃連接過夜.取10μL連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素的LB平皿上，37℃培養(yǎng)過夜挑選單克隆繼續(xù)培養(yǎng)后提質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I／HindⅢ雙酶切以及EcoRⅠ單酶切驗(yàn)證.取經(jīng)酶切鑒定后的陽性克隆，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序.據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用Blast軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)放線菌菌株的16S rRNA序列，隨后用mega軟件進(jìn)行多序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源性比較.

2 結(jié)果

2.1 菌株XJ－1和XJ－4的形態(tài)和培養(yǎng)特征

菌株XJ－1和XJ－4在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上生長最好，馬鈴薯浸汁瓊脂、高氏一號(hào)瓊脂、察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長適中，無機(jī)鹽淀粉瓊脂、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長均較差，在所有培養(yǎng)基上都無可溶性色素產(chǎn)生.菌株XJ－1的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲均較豐富，氣生菌絲主要呈黃白色系，基內(nèi)菌絲主要呈現(xiàn)棕色色系.基內(nèi)菌絲纖細(xì)分支，孢子鏈呈現(xiàn)短串狀，較伸直，螺旋纏繞很少（圖1a），孢子橢圓形.菌株XJ－4氣生菌絲較稀少，主要呈粉白色系，氣生菌絲上著生長短不一的孢子鏈（圖1b），伸直或螺旋纏繞，孢子橢圓形.基內(nèi)菌絲稀少分支，顏色較單一，基本為黃棕色.菌株XJ－1和XJ－4的培養(yǎng)特征見表1.

圖1 菌株XJ－1和XJ－4在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的光鏡照片（×1 000）Fig.1 Morphological characteristics of strains XJ－1和 XJ－4on Oatmeal agar medium

表1 2株嗜堿性放線菌菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征Tab.1 Cultural characteristics of two basophilic actinomycosis

2.2 菌株XJ－1和XJ－4的生理生化特性

兩株嗜堿性放線菌菌株的生理生化特性見表2.兩株放線菌菌株的大部分生理生化特征很相似，只是在個(gè)別糖類利用方面有區(qū)別.兩株放線菌菌株碳源利用譜均不寬，產(chǎn)生卵磷脂酶，水解淀粉，纖維素分解呈陰性.均不產(chǎn)生黑色素和硫化氫，牛奶凝固和胨化強(qiáng).菌株XJ－1的明膠液化呈陽性，而菌株XJ－4的明膠液化呈陰性.

兩株嗜堿性放線菌菌株的NaCl耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株XJ－1和XJ－4的最高耐鹽程度均為10%，屬于輕度耐鹽菌.兩株放線菌菌株最適生長溫度均為37℃，最高耐受溫度為45℃，最適生長pH為10.0，在中性pH條件下不能生長，屬于嗜堿性放線菌.兩株嗜堿性放線菌菌株部分生理生化特性見表2.

表2 2株嗜堿性放線菌菌株部分生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical properties of two basophilic actinomycosis

續(xù)表2

2.3 菌株XJ－1和XJ－4的16SrRNA序列分析

菌株XJ－1的16SrRNA核苷酸序列長度為1 500bp，XJ－4的16SrRNA核苷酸序列長度為1 501bp.以上2株嗜堿性放線菌菌株的16SrRNA核苷酸序列已被GenBank注冊(cè)，XJ－1和XJ－4的注冊(cè)號(hào)分別為EU882851和EU882852.

將這兩株嗜堿性放線菌的16SrRNA序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，利用比對(duì)結(jié)果從Gen－Bank數(shù)據(jù)庫收集其它放線菌菌株的16SrRNA相應(yīng)序列，運(yùn)用MEGA軟件Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)分析，按照Neighbor－joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）.如圖2所示，XJ－1屬于擬諾卡氏菌屬，它與擬諾卡氏菌屬的Nocardiopsis.dassonvillei聚為同一支，進(jìn)化距離最近，利用DNAMAN軟件比對(duì)其序列相似性達(dá)到了99.9%.XJ－4也屬于擬諾卡氏菌屬，它與Nocardiopsis.sp.AF－333的進(jìn)化距離最近，同樣利用DNAMAN軟件比對(duì)其序列相似性達(dá)到了99.3%.

圖2 基于16SrRNA序列用Neighour－joining方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖Fig.2 Phylogenetic tree showing the relationships among type strains and experimental strains based on 16SrRNA sequences with Neighour－joining method

2.4 菌株XJ－1和XJ－4產(chǎn)生的抗生素活性分析測(cè)定結(jié)果

堿性放線菌XJ－1可以產(chǎn)生抗生素，該菌株對(duì)于柑橘綠霉菌、水稻輪紋菌、棉花枯萎菌、小麥赤霉菌四種植物病原菌均有一定的抗性作用，其中對(duì)于抑制柑橘綠霉菌的抑制作用最為明顯，尤其是抑制柑橘綠霉菌的孢子生長比較有效.通過抑制菌絲生長速率法進(jìn)一步測(cè)定了XJ－1菌株發(fā)酵液對(duì)于以上4種植物病原菌的抑制作用.表3為XJ－1菌株對(duì)于植物病原菌的抑菌圈直徑（抑菌圈直徑＝水解圈直徑－菌餅直徑）以及抑制率.XJ－4沒有檢測(cè)到抗生素活性.

表3 XJ－1菌株的抗菌性能Tab.3 Antibiotic activities of strain XJ－1

3 討論

綜合以上2株嗜堿性線菌菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征、生理生化特性以及其16SrRNA序列分析，再結(jié)合構(gòu)建的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)：XJ－1具備擬諾卡氏菌屬的基本特征，而且其與Nocardiopsis das－sonvillei的序列相似性達(dá)到了99.9%，所以初步確定其屬于擬諾卡氏菌屬的Nocardiopsis dassonvillei.而XJ－4與Nocardiopsis.sp.AF－333聚為1支，序列同源性達(dá)到了99.3%，運(yùn)用DNAMAN軟件將其于擬諾卡氏菌屬的其他已知種進(jìn)行了一系列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的16SrRNA序列和擬諾卡氏菌屬已知種的序列相似性比對(duì)均大于2%，與尼諾卡式菌屬的未知種Nocardiopsis.sp.AF－333的序列同源性最大，推斷其可能是一新種.

柑橘綠霉菌是致柑橘采后發(fā)生貯藏病害的主要致病菌，其生命力非常旺盛，尤其是其孢子增殖能力很強(qiáng)，即使在惡劣條件下也能快速繁殖.據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于青霉病和綠霉病的感染柑橘采后損失為30%～50%［15］.目前有效的防治技術(shù)是使用大量的化學(xué)殺菌劑［16］.但長期使用殺菌劑，易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，也可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量對(duì)人體有害.生物防治對(duì)其是一個(gè)有效的途徑，分離鑒定的XJ－1放線菌菌株對(duì)于柑橘綠霉菌的抑制作用，可以進(jìn)一步研究以生物制劑代替化學(xué)防腐保鮮劑，有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義.

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Isolation，identification and characterization of two basophilic actinomycosis

XIONG Ying1，YU Jinhui1，Abdukerim Rehim2，WEI Yanhong1，LI Yi1，MO Xiaoyan1，CHEN Huxin1，YUAN Yongze1，LIU Deli1
（1.College of Life Science，Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，Huazhong Normal University，Wuhan 430079；2.College of Life Science and Chemistry，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054）

Two actinomycete strains XJ－1and XJ－4were isolated from the alkaline soil of Shuo County and BaZhou County in Xinjiang Province.Based on the morphology，physiological and biochemical characteristics，antibiotics production and 16SrRNA gene sequence analysis，the results showed that the optimum growth pH of these two basophilic actinomycosis was 10.0；they could not grow in the neutral conditions of pH7.0 and could grow in the strong alkaline conditions of pH12.0.Two actinomycete strains had a tolerance of 10%NaCl and the highest tolerance of temperature were 45℃.XJ－1 was able to produce antibiotics.It could obviously inhibit the growth of Penicillium digitatum，but also inhibit the growth of Rhizoctonia solani，F(xiàn)usariumoxysporum and Fusarium raminearum.XJ－1was preliminarily determined to be the Nocardiopsis dassonvillei，their sequence similarity reached 99.9%.The homology of the 16SrDNA sequences of strain XJ－4with Nocardiopsis.sp.AF－333was more than 99.0%，so the strain XJ－4maybe a new species belonged to the basophilic actinomycetes.

basophilic actinomycosis；isolation；identification；antibiotics.

Q93

A

1000－1190（2012）05－0596－05

2012－02－21.

湖北省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2007AA301C26，2007AA201C50）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20060511002）.

＊通訊聯(lián)系人.E－mail：deliliu2002＠yahoo.com.cn.