金屬硫蛋白對(duì)熱應(yīng)激奶牛血淋巴細(xì)胞凋亡基因和HSP70基因表達(dá)的影響

羅佳捷，吳宗明，張彬＊，李麗立，吳力專(zhuān)，陳宇光，肖定福，畢小艷

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410125）

熱應(yīng)激對(duì)奶牛生產(chǎn)性能、繁殖性能及免疫性能等方面均有不利影響［1－3］，探索減少或緩解熱應(yīng)激的途徑一直是奶牛飼養(yǎng)業(yè)的重大課題之一。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種低分子量、富含金屬和半胱氨酸的功能性結(jié)合蛋白，是遍布于哺乳動(dòng)物各個(gè)組織且具有廣泛而重要生理學(xué)和生物學(xué)功能的天然生物活性物質(zhì)［4］。MT的主要作用是參與微量元素儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，重金屬解毒，拮抗電離輻射，清除羥基自由基，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高抗應(yīng)激和抗氧化能力，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和能量代謝的調(diào)節(jié)過(guò)程，其中尤以清除羥基自由基、抗應(yīng)激和抗氧化的作用大，其研究和開(kāi)發(fā)涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健、生物工程和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域［5－10］。近年來(lái)，有關(guān)學(xué)者初步研究了MT在奶牛體內(nèi)的代謝規(guī)律及其對(duì)奶?？篃釕?yīng)激調(diào)控的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)MT能通過(guò)提高奶牛體內(nèi)超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）基因的表達(dá)水平來(lái)顯著提高奶牛的抗熱應(yīng)激和抗氧化能力［11－14］，但此類(lèi)研究較少，且欠深入。有研究指出，熱休克蛋白HSP70和抗細(xì)胞凋亡基因Bcl－2均能有效提高機(jī)體對(duì)抗熱應(yīng)激的能力［15，16］，Bax和p53基因則能通過(guò)促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞凋亡來(lái)削弱機(jī)體抗應(yīng)激的能力［17－19］，而MT對(duì)奶牛體內(nèi)HSP70和細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探索外源性MT對(duì)奶牛體內(nèi)HSP70、Bcl－2、Bax和p53基因表達(dá)的影響，為揭示MT調(diào)控奶牛抗熱應(yīng)激機(jī)理的理論研究及其在奶業(yè)安全生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其來(lái)源

金屬硫蛋白使用湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽品質(zhì)改良實(shí)驗(yàn)室建立的方法誘導(dǎo)合成、分離和純化的奶牛肝臟鋅金屬硫蛋白（Zn－MT）［20］，并用該實(shí)驗(yàn)室建立的間接競(jìng)爭(zhēng)型酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法定量［21］。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2010年7月27日－8月17日在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛場(chǎng)進(jìn)行，選取年齡、體重、胎次、產(chǎn)犢時(shí)間、泌乳量及以往泌乳期產(chǎn)奶成績(jī)相近的中國(guó)荷斯坦奶牛經(jīng)產(chǎn)泌乳母牛25頭，隨機(jī)均分為A、B、C、D、E 5組，每組5頭。其中A組為對(duì)照組，B、C、D、E組為試驗(yàn)組，分別在正式試驗(yàn)開(kāi)始的當(dāng)天（1d）每頭頸靜脈注射經(jīng)生理鹽水溶解的Zn－MT 16.0，24.0，32.0和40.0mg。試驗(yàn)期為15d（1～15d）。

1.3 飼養(yǎng)管理方式

試驗(yàn)?zāi)膛Ｔ谕慌Ｉ嵋噪p列對(duì)尾栓系式飼養(yǎng)，每頭牛1個(gè)牛床。各組奶牛飼喂相同日糧，日糧系奶牛場(chǎng)參照美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)（national research council，NRC）（2001）和《中國(guó)奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2004）自行配制，其組成為（kg／頭）：玉米3.136、麥麩0.728、豆粕0.504、棉粕0.448、菜粕0.280、酵母粉0.280、磷酸氫鈣0.056、石粉0.056、碳酸氫鈉0.056、稻草10、象草20；日糧營(yíng)養(yǎng)水平：產(chǎn)奶凈能（net energy for lactation，NEL）86.60MJ／（頭·d）、奶牛能量單位（Nainiu Nengliang Danwei，NND）27.60／（頭·d）、粗蛋白質(zhì)（crude protein，CP）1 585.60 g／（頭·d）、Ca 57.44g／（頭·d）、P 32.80g／（頭·d）。專(zhuān)人飼養(yǎng)管理，各組飼養(yǎng)管理方式一致，每天記錄產(chǎn)奶量。

1.4 采樣

在試驗(yàn)期的第1（注射MT前），7和14天分別從供試奶牛的尾靜脈采血。每次采血約為20mL，用肝素鈉（3.2mL，250U／mL）抗凝全血，馬上分離淋巴細(xì)胞或放入4℃冰箱保存待用。

1.5 基因表達(dá)分析

1.5.1 引物設(shè)計(jì)及合成 基因表達(dá)分析采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法，根據(jù)網(wǎng)上（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）發(fā)表的基因序列，以Beta－actinmRNA和3－磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease gene，GAPDH）mRNA 作內(nèi)參，根據(jù)GenBank中奶牛的HSP70、Bcl－2、Bax、p53、GAPDH和Beta－actin的基因登陸序列（依次為 BTU09861、BTU92434、BTU92569、BC102440.1、BTU85042和BC142413），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5.2 血液淋巴細(xì)胞及總RNA的提取 血液淋巴細(xì)胞用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行提取，所有過(guò)程均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行。

表1 HSP70、Bcl－2、Bax、p53、GAPDH 和Beta－actin基因的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design for HSP70，Bcl－2，Bax，p53，GAPDHand Beta－actin

1.5.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA 采用 Revert AidTM First Strand cDNA Systhesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.4 cDNA的RT－PCR反應(yīng)體系HSP70、Bcl－2、Bax和p53的熒光定量RT－PCR反應(yīng)體系各成分及加樣量見(jiàn)表2。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min，進(jìn)行如下循環(huán)：95℃15s，60℃15s，72℃45s；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min，4℃保存。

1.5.5 RT－PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與相對(duì)定量 所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶，條件為：90V，60 min，凝膠電泳成像系統(tǒng)成像，以50bp Marker作對(duì)照檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)條帶大小是否與β－actin產(chǎn)物大小相同。本試驗(yàn)中將cDNA 樣品進(jìn)行1，5，25，125，625，3 125倍稀釋?zhuān)瑢?duì)目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以cDNA稀釋倍數(shù)取對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，△Ct值為縱坐標(biāo)作圖，得到回歸線(xiàn)y＝0.062 9x＋6.058，R2＝0.55，曲線(xiàn)斜率為0.062 9，說(shuō)明目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致，可以用2－△△Ct法計(jì)算本試驗(yàn)中基因相對(duì)表達(dá)量，即以對(duì)照組基因表達(dá)量為1倍，處理組表達(dá)量為相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。

表2 RT－PCR反應(yīng)體系各成分及加樣量Table 2 Ingredients and adding－sample amount of RT－PCR reaction system

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步處理后，再使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行成對(duì)樣本差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，檢驗(yàn)誤差為5%和1%水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量MT對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能的影響

注射外源性MT后，各試驗(yàn)組奶牛的產(chǎn)奶性能較A組均有提高（表3），其中B、C組在試驗(yàn)期第7和14天的產(chǎn)奶量均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于A組；D、E組在試驗(yàn)期第7天的產(chǎn)奶量雖然較A組有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），而到試驗(yàn)期第14天時(shí)差異均達(dá)到顯著（P＜0.05）水平。這說(shuō)明較低劑量（16.0和24.0mg）的MT在注射后馬上發(fā)揮了效用，而較高劑量（32.0和40.0mg）的 MT在注射7d后才開(kāi)始發(fā)揮功效。從各試驗(yàn)組奶牛在正式試驗(yàn)期產(chǎn)奶量的平均值看，B、C、D和E組的產(chǎn)奶量比對(duì)照組分別高出20.94%（P＜0.05）、15.83%（P＞0.05）、10.94%（P＞0.05）和8.85%（P＞0.05）。說(shuō)明16.0mg的 MT注射量對(duì)熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶性能的改善作用最為顯著。

表3 不同劑量MT對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能的影響Table 3 Effects of MT in different dosages on milk producing ability of dairy cattle kg／d

2.2 不同劑量MT對(duì)奶牛HSP70基因表達(dá)水平的影響

在正式試驗(yàn)開(kāi)始的當(dāng)天（補(bǔ)給外源性MT前），各組奶牛血液中HSP70基因的表達(dá)水平均無(wú)顯著（P＞0.05）差異（表4）。補(bǔ)給MT后，4個(gè)試驗(yàn)組奶牛HSP70基因的表達(dá)水平均有一定程度的提高，其中C組在試驗(yàn)期第14天、D組在試驗(yàn)第7和14天HSP70基因的表達(dá)水平均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。就正式試驗(yàn)期所測(cè)奶牛HSP70基因表達(dá)水平的平均值看，D組較對(duì)照組有顯著（P＜0.05）提高，而B(niǎo)、C、E組雖高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明通過(guò)注射32.0mg劑量的外源性MT對(duì)奶牛HSP70基因表達(dá)量產(chǎn)生了積極的影響。

表4 不同劑量MT對(duì)奶牛HSP70基因表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of MT in different dosages on HSP70gene expression levels of dairy cattle

2.3 不同劑量MT對(duì)奶牛Bcl－2基因表達(dá)水平的影響

補(bǔ)給外源性MT前，各組奶牛血液淋巴細(xì)胞中Bcl－2基因的表達(dá)水平差異不顯著（P＞0.05）（表5）。注射MT后，C組在試驗(yàn)期第7和14天、D組在試驗(yàn)期第7天及E組在試驗(yàn)期第14天Bcl－2基因的表達(dá)水平均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照組；而B(niǎo)組Bcl－2基因的表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。從正式試驗(yàn)期各組奶牛Bcl－2基因表達(dá)水平的平均值看，C組顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。說(shuō)明24.0mg劑量的MT對(duì)奶牛Bcl－2基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用最為顯著。

表5 不同劑量MT對(duì)奶牛Bcl－2基因表達(dá)水平的影響Table 5 Effects of MT in different dosages on Bcl－2gene expression levels of dairy cattle

2.4 不同劑量MT對(duì)奶牛Bax基因表達(dá)水平的影響

在正式試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（注射外源性MT前），各組奶牛血液淋巴細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)水平均無(wú)顯著（P＞0.05）差異（表6）。注射MT后，B組奶牛在試驗(yàn)第7天、D組奶牛在試驗(yàn)期第14天Bax基因的表達(dá)水平均顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組；B、E組奶牛在試驗(yàn)期第14天及D組奶牛在試驗(yàn)期第7天Bax基因的表達(dá)水平雖然較對(duì)照組有所降低，但未達(dá)到顯著（P＞0.05）水平；而C組在試驗(yàn)期第7和14天Bax基因的表達(dá)水平比對(duì)照組有所提高，但差異也不顯著（P＞0.05）。就正式試驗(yàn)期各組奶牛Bax基因表達(dá)水平的平均值看，盡管B、D兩組Bax基因的表達(dá)水平分別較對(duì)照組下降了22.00%（P＞0.05）和13.00%（P＞0.05），但各組之間差異均未達(dá)到顯著水平。

2.5 不同劑量MT對(duì)奶牛p53基因表達(dá)水平的影響

在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（注射外源性MT前），各組奶牛血液淋巴細(xì)胞中p53基因的表達(dá)水平均無(wú)顯著（P＞0.05）差異（表7）。注射MT后，B組奶牛在試驗(yàn)期第7天、C組奶牛在試驗(yàn)期第7和14天、D組奶牛在試驗(yàn)期第14天及E組奶牛在試驗(yàn)期第7和14天p53基因的表達(dá)水平要顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）低于對(duì)照組。就正式試驗(yàn)期各組奶牛p53基因表達(dá)水平的平均值看，C、E兩組分別較對(duì)照組下降了22.00%（P＞0.05）和34.00%（P＞0.05）。說(shuō)明24.0和40.0mg劑量的外源性MT能對(duì)奶牛血液淋巴細(xì)胞中p53基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的抑制作用。

表6 不同劑量MT對(duì)奶牛Bax基因表達(dá)水平的影響Table 6 Effects of MT in different dosages on Baxgene expression levels of dairy cattle

表7 不同劑量MT對(duì)奶牛p53基因表達(dá)水平的影響Table 7 Effects of MT in different dosages on p53gene expression levels of dairy cattle

3 討論

3.1 MT對(duì)奶牛產(chǎn)奶性能的影響

張彬等［11］認(rèn)為，MT是機(jī)體內(nèi)清除自由基能力最強(qiáng)的一種蛋白質(zhì)，能夠有效調(diào)控奶牛泌乳量和抗氧化能力，及時(shí)清除體內(nèi)自由基，修復(fù)細(xì)胞氧化損傷。當(dāng)牛舍的溫濕指數(shù)（THI）大于72時(shí)，奶牛就處于熱應(yīng)激狀態(tài)［22］，奶牛受熱應(yīng)激的影響，直腸溫度、呼吸頻率和脈搏等3項(xiàng)生理常數(shù)指標(biāo)均會(huì)顯著升高，直接影響到奶牛的采食量，并最終導(dǎo)致產(chǎn)奶量的顯著下降［23］。在本研究中，試驗(yàn)期間奶牛舍的THI均大于76，說(shuō)明奶牛一直處于熱應(yīng)激狀態(tài)。對(duì)照組奶牛產(chǎn)奶量的逐步減少反應(yīng)了熱應(yīng)激對(duì)奶牛產(chǎn)生的不利影響，而MT注射組奶牛的產(chǎn)奶量卻有不同程度的提高，4個(gè)試驗(yàn)組全期產(chǎn)奶量的平均值分別比第1天高出4.41%，4.12%，3.70%和0.97%，分別比對(duì)照組高出20.94%，15.83%，10.94%和8.85%，說(shuō)明MT對(duì)奶牛熱應(yīng)激有很好的緩解作用，能有效清除熱應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)量自由基，增強(qiáng)奶牛機(jī)體抗氧化功能，進(jìn)而增加采食量，提高奶牛的產(chǎn)奶性能。此外，吳力專(zhuān)等［5］研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血清中胰島素（INS）、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）和甲狀腺素（T3）的含量在注射MT后均顯著升高，說(shuō)明外源性MT還能通過(guò)控制奶牛機(jī)體產(chǎn)能來(lái)調(diào)節(jié)體溫，從而提高奶牛的產(chǎn)奶性能。在本研究中，高劑量的MT發(fā)揮作用較晚可能是因?yàn)闄C(jī)體對(duì)高劑量的外源性物質(zhì)有一定的排斥性，需要一定的時(shí)間來(lái)接受和適應(yīng)；MT提高產(chǎn)奶量的效果隨劑量的增加依次降低可能是受到試驗(yàn)期長(zhǎng)度的局限，因?yàn)楦邉┝縈T發(fā)揮作用較晚，因此在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)還沒(méi)有完全發(fā)揮出作用。

3.2 MT對(duì)奶牛HSP70基因表達(dá)的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，HSP的合成在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)會(huì)增加，而其他蛋白的合成則減少，并認(rèn)為HSPmRNA優(yōu)先翻譯是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)存在識(shí)別HSPmRNA 5′前導(dǎo)區(qū)特異結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，可以選擇性地將其翻譯出來(lái)［24］；Wang和E－dens［25］通過(guò)培養(yǎng)牛、羊、馬和雞的淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HSP70和HSP90在熱應(yīng)激條件下的表達(dá)顯著增加。HSP70可以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，以分子伴侶的形式調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的代謝，HSP70家族在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)或數(shù)量的增多可以改善細(xì)胞的生存能力，提高熱應(yīng)激耐受力。當(dāng)機(jī)體受到熱應(yīng)激時(shí)，HSP70的表達(dá)水平一般會(huì)立即提高，以保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。MT和HSP70作為2種重要的抗應(yīng)激蛋白，一般在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，兩者之間相互作用，共同增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)各種損害的耐受程度［26］。本研究中，各試驗(yàn)組奶牛體內(nèi)HSP70基因的表達(dá)水平在注射MT后均立刻提高，且平均值比對(duì)照組分別提高了19.00%，57.00%，130.00%和17.00%，說(shuō)明外源性MT可能通過(guò)抗氧化途徑進(jìn)一步激活了HSP70基因的表達(dá)，從而達(dá)到更好緩解奶牛熱應(yīng)激的目的，且存在明顯的劑量效應(yīng)。其中，D組的水平明顯好于其他組，表明32.0mg的MT注射量對(duì)于提高HSP70基因的表達(dá)是最為有利的；而E組的水平與D組相比又陡然下降，這可能是因?yàn)镋組外源性MT的注射劑量過(guò)高，使動(dòng)物機(jī)體由于排斥性等問(wèn)題不能完全的將其利用，致使其效應(yīng)反不如注射劑量稍低的D組。

3.3 MT對(duì)奶牛Bcl－2、Bax和p53基因表達(dá)的影響

本研究之所以探索MT對(duì)奶牛血淋巴細(xì)胞Bcl－2、Bax和p53基因表達(dá)水平的影響，是基于MT及細(xì)胞凋亡基因?qū)C(jī)體抗熱應(yīng)激的重要性。Bcl－2是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的抗凋亡基因，能夠有效延長(zhǎng)細(xì)胞周期［27］；Bax屬于Bcl－2家族，通過(guò)與Bcl－2形成二聚體抑制Bcl－2的功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；p53調(diào)控一些僅有BH3區(qū)域的蛋白，作為Bax的上游調(diào)控基因，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能十分顯著［28，29］。p53作為促細(xì)胞凋亡因子，其高表達(dá)能上調(diào)Bax的表達(dá)和減少Bcl－2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl－2又能抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。當(dāng)p53基因失活時(shí)，引起B(yǎng)cl－2家族基因調(diào)控失衡，凋亡抑制基因Bcl－2的表達(dá)水平升高，導(dǎo)致靶細(xì)胞不易誘發(fā)細(xì)胞凋亡［30］，因而p53與Bcl－2家族基因的調(diào)控作用是相互聯(lián)系的。熱應(yīng)激能增加HSP的釋放而增加機(jī)體免疫力，抑制細(xì)胞凋亡，HSP70和HSP90通過(guò)與p53形成復(fù)合體來(lái)阻礙p53進(jìn)入細(xì)胞核，從信號(hào)傳導(dǎo)途徑上抑制了細(xì)胞凋亡［31］。孫忠東等［32］研究表明，MT的高表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，Bcl－2表達(dá)增多同時(shí)Bax和Fas表達(dá)明顯減少；Shimoda等［33］也曾提出MT是細(xì)胞凋亡的抑制劑。本研究中，各劑量的MT均使Bcl－2基因的表達(dá)水平明顯升高，基本上與HSP70基因表達(dá)水平升高的趨勢(shì)相一致，其中24.0mg劑量組達(dá)到顯著水平；在Bcl－2基因表達(dá)水平升高的同時(shí)，Bax和p53基因的表達(dá)水平也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明外源性MT能通過(guò)增加HSP70的表達(dá)來(lái)抑制p53基因的促凋亡功能。但B組在試驗(yàn)期第14天和D組在試驗(yàn)期第7天p53基因的表達(dá)呈現(xiàn)出相對(duì)較高的水平，B組可能是因?yàn)橥庠葱訫T劑量不夠，而D組則可能是由于試驗(yàn)前期MT要大量清除氧化自由基，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加速修復(fù)熱應(yīng)激所致細(xì)胞損傷，因而促進(jìn)了p53基因過(guò)表達(dá)，試驗(yàn)后期奶牛應(yīng)激趨于平穩(wěn)，細(xì)胞應(yīng)激敏感性降低，為維持機(jī)體穩(wěn)定代謝，抑制細(xì)胞凋亡，p53基因的表達(dá)水平逐步降低。

［1］West J W.Effects of heat－stress on production in dairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，2003，86：2131－2144.

［2］李建國(guó).熱應(yīng)激對(duì)奶牛生理常值、血液生化指標(biāo)、繁殖及泌乳性能的影響［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，21（4）：69－74.

［3］Gwazdauskas F C.Effects of climate on reproduction in cattle［J］.Journal of Dairy Science，1985，68：1568－1578.

［4］吳力專(zhuān)，李麗立，張彬.金屬硫蛋白在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)上的應(yīng)用［J］.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，3（1）：156－160.

［5］吳力專(zhuān)，陳海燕，張彬，等.外源性金屬硫蛋白對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)能性能和內(nèi)分泌的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：183－188.

［6］Ajij H R，Kojima Y.Chemistry and biochemistry of metallothionein［J］.Experimental Biology，1987，52：25－61.

［7］De S K，McMaster T，Andrews G K.Endotoxin indution of metallothionein in gene expression［J］.Journal of Biochemistry，1990，265（25）：1526－1538.

［8］Green E M，Adams H R.New perspectives in circultory shock：Pathophysiologic mediator of the mammalian response to endotoxemia and sepsis［J］.Journal of American Veterinary Medicine，1992，200（12）：1817－1826.

［9］Miura T，Muroaka S，Ogiso T，et al.Antioxidant activity of metallothionein compared with reduced glurathione［J］.Life Science，1997，60（21）：301.

［10］Kondoh M，Inoue Y.Specific induction of metallothionein synthesis by mitochondrial oxidative stress［J］.Life Science，2001，69：2137－2146.

［11］張彬，譚瓊，肖兵南，等.外源性金屬硫蛋白對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和抗氧化狀況的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18（6）：137－143.

［12］張彬，肖定福，李麗立，等.金屬硫蛋白在奶牛公犢體內(nèi)的代謝規(guī)律研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（6）：178－184.

［13］張彬，薛立群，李麗立，等.外源金屬硫蛋白對(duì)奶?？篃釕?yīng)激調(diào)控及SOD基因表達(dá)的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（1）：193－198.

［14］張彬，譚瓊，李麗立，等.金屬硫蛋白對(duì)奶牛血液抗氧化酶GSH－Px和CAT基因表達(dá)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（3）：132－138.

［15］Xu C S，Xin Z H，Yuan J Y.Advance in research on biological function and transcriptional control of heat shock proteins［J］.Developmental and Reproductive Biology，2002，11（2）：88－94.

［16］宋學(xué)立，錢(qián)令嘉，李鳳芝，等.Bcl－2基因轉(zhuǎn)染對(duì)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2002，18（4）：347－349.

［17］Santini D，Tonini G，Vecchio F M，et al.Prognostic value of Bax，Bcl－2，p53，and tunel staining in patients with radically resected ampullary carcinoma［J］.Journal of Clinical Pathology，2005，58（2）：159－165.

［18］Karin A，Marsha V，Mieke B B，et al.Estrous cycle dependent changes in expression and distribution of Fas，F(xiàn)as ligand，Bcl－2，Bax，and active caspase－3in the rat ovary［J］.Journal of Endocrinology，2006，188（2）：179－192.

［19］Sheard M A.Lonizing radiation as a response－enhancing agent for CD95－mediated apoptosis［J］.International Journal of Cancer，2001，96（3）：213－220.

［20］李麗立.一種豬肝金屬硫蛋白提取方法：中國(guó)，ZL 200410013212.X［P］.2006－04－17.

［21］張彬，吳力專(zhuān)，李麗立.一種豬金屬硫蛋白的測(cè)定方法：中國(guó)，ZL 200410061265.9［P］.2007－05－07.

［22］Lemerle C，Goddard M E.Assessment of heat stress in dairy cattle in Papua New Guinea［J］.Tropical Animal Health and Production，1986，18（4）：232－242.

［23］楊毅，梁榮嶸，劉慶華.輕微至中度熱應(yīng)激對(duì)荷斯坦奶牛生理指標(biāo)及產(chǎn)奶性能的影響［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（24）：28－31.

［24］McGarry T J，Lindquist S.The preferential translation of Drosophila HSP70mRNA requires sequences in the untranslated leader［J］.Cell，2005，42（17）：903－910.

［25］Wang S，Edens F W.Stress－induced heat shock protein synthesis in peripheral leukoeytes of turkeys，Meleagris gallopavo［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，1993，106：621－628.

［26］邱恩惠.慢性鼻竇炎嗅覺(jué)障礙嗅上皮中HSP70、MT及NSE的表達(dá)及意義［D］.福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2009.

［27］Vaux D L，Cory S，Adams J M.Bcl－2gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates witn c－myc to irnrnortalize pre－B cell［J］.Nature，1988，335（6189）：440－442.

［28］Alvarez S，Drane P，Meiller A.A comprehensive study of p53transcriptional activity in thymus and spleen of gamma irradiated mouse：High sensitivity of genes involved in the two main apoptotic pathways［J］.International Journal of Radiation Biology，2006，82（11）：761－770.

［29］Vanlandingham J W，Tassabehji N M，Somers R C，et al.Expression profiling of p53－target genes in copper－mediated neuronal apoptosis［J］.Neuromolecular Medicine，2005，7（4）：311－324.

［30］Zhan Q，Alamo I，Yu K，et al.The apoptosis－associated gamma－ray response of Bcl－xl depends on normal p53function［J］.Oncogene，1996，13（10）：2287－2293.

［31］林如輝，劉健.熱療與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2006，10（3）：12－15.

［32］孫忠東，高尚志，毛志福.金屬硫蛋白對(duì)供心細(xì)胞Bcl－2、Bax和Fas蛋白表達(dá)的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22（3）：375.

［33］Shimoda R，Achanzar W E，Qu W，et al.Metallothionein is a potential negative regulator of apoptosis［J］.Toxicological Sciences，2003，73（2）：294－300.