柳枝稷人工穗芽高效再生體系的建立

柴乖強，徐開杰，王勇峰，孫風麗，宋立立，劉曙東，奚亞軍＊

（1.西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西 楊凌712100；2.滄州師范學院生命科學系，河北 滄州061001）

隨著社會的發(fā)展，人類對能源的需求日益劇增。然而全球化石能源的不可再生性以及大量使用導致了大氣污染、全球氣候變暖等一系列環(huán)境問題［1，2］。因此，尋求一種新的可再生替代能源成為擺在人們面前的一項重要的工作。柳枝稷（Panicumvirgatum）原產(chǎn)于北美，屬禾本科（Gramineae）黍?qū)伲≒anicum），是一種多年生暖季型草本C4植物［3，4］，通常被用來放牧、水土保持以及生態(tài)建設。與傳統(tǒng)作物相比，柳枝稷的抗旱能力強、耐瘠薄、病蟲害少、生物學產(chǎn)量高，加上易播種出苗和建立植被以及纖維素和半纖維素能較高地轉(zhuǎn)化為乙醇等優(yōu)點，近年來被國際上廣泛作為一種理想的生物能源植物并進行了深入研究［5－8］。保存和快速繁殖優(yōu)質(zhì)原始材料是支撐現(xiàn)代生物育種技術(shù)發(fā)展的重要內(nèi)容之一。為了適應現(xiàn)代生物育種工作的需要，柳枝稷的離體培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)受到了越來越多的重視。孟敏等［9］、Jason等［10］均以柳枝稷幼穗和成熟種子為外植體，通過誘導胚性愈傷組織增殖出大量的柳枝稷幼苗。然而，由于柳枝稷在人工誘導愈傷組織方面受基因型限制，且存在培養(yǎng)周期長，再生率低等缺點，使其在柳枝稷離體培養(yǎng)和快速繁殖上的應用受到了一定限制。

利用植物不同器官作為外植體誘導叢生芽進而建立高效再生體系，是組織培養(yǎng)最直接、最簡便、成苗速度最快的途徑之一［11］。迄今已有多種植物利用芽頂端分生組織［12－17］或莖節(jié)［18］為外植體誘導叢生芽，從而建立了其植株再生體系。而通過幼穗直接誘導人工穗芽目前還未見報道。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，在人工誘導柳枝稷的幼穗形成過程中，通過人工處理可獲得少量幼芽（人工穗芽），在適宜培養(yǎng)基上誘導和人工促進可使穗芽在短時間內(nèi)大量擴增，通常形成包含數(shù)十條或一百余條不等的穗芽塊，為避開傳統(tǒng)通過胚性愈傷組織再生植株建立了一條簡便易行的途徑。本試驗通過對柳枝稷人工穗芽的培養(yǎng)條件、處理方法等進行系統(tǒng)研究，以期建立較為高效的柳枝稷人工穗芽再生體系，為柳枝稷的離體繁殖乃至生物技術(shù)育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為‘西稷1號’、‘西稷2號’和‘西稷3號’3個基因型，由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院柳枝稷分子育種課題組選育提供。試驗于2010年8月－2011年5月在西北農(nóng)林科技大學小麥改良中心分子生物學實驗室進行。

1.1.2 試驗初始培養(yǎng)基 誘導與增殖培養(yǎng)基：MS（Murashige and Skoog）＋3.00mg／L 6－BA（6－Benzylamin－opurine）＋3.00%蔗糖＋0.75%瓊脂，pH 值5.8；生根培養(yǎng)基：1／2MS＋1.00%蔗糖＋0.70%瓊脂，pH 值5.8。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用單因素尋優(yōu)的方法，以誘導與增殖培養(yǎng)基為初始基本培養(yǎng)基，各單因素試驗依次以前一試驗研究結(jié)果為基礎，依次從柳枝稷的基因型、幼穗長度、激素、初次切割時期穗芽長度、大量培養(yǎng)階段穗芽長度、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式和生根培養(yǎng)基等進行培養(yǎng)因素的優(yōu)化選擇，以建立柳枝稷人工穗芽高效再生體系。試驗各因素包括水平如下：基因型三水平包括西稷1號、西稷2號、西稷3號；幼穗長度四水平包括0.5，1.0，1.5和2.0cm；激素處理五水平分別為2.00mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D，2.50mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D，3.00mg／L 6－BA，3.00mg／L 6－BA＋0.10mg／L 2，4－D，MS＋3.50mg／L 6－BA；初次切割時期穗芽長度四水平包括初次穗芽長度0.5，1.0，1.5和2.0cm；大量培養(yǎng)階段穗芽長度四水平包括穗芽長1.0，1.5，2.0和2.5cm；碳源三水平包括30g／L蔗糖、30g／L麥芽糖、30g／L甘露醇；pH 值五水平分別為5.4，5.6，5.8，6.0，6.2；穗芽塊的切割方式兩水平包括橫切和縱切；4種生根培養(yǎng)基分別為1／2MS、1／2MS＋0.5mg／L IBA、1／2MS＋0.5mg／L NAA 和1／2MS＋0.5mg／L IBA＋0.5mg／L NAA。

1.2.2 外植體的準備與誘導 在柳枝稷生長發(fā)育至有5～6個節(jié)時，人工剝?nèi)?cm左右的穗下莖節(jié)。先用體積分數(shù)為70%的酒精表面消毒1min，倒掉酒精后加入適量體積分數(shù)為5%的NaClO（有效氯≥0.9%）溶液滅菌約1～2min，再用無菌水沖洗3～4次。

將滅好菌的幼穗用無菌手術(shù)刀從中間縱切成兩半，根據(jù)各試驗進程，依次分別接種到上述各培養(yǎng)基中，每個處理重復3次，每個重復接種3個幼穗。并置于28℃，光照16h／d，光照強度12 000lx的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每次從誘導好的穗芽基部2mm處切去穗芽，人工切割5次后，于超凈工作臺內(nèi)調(diào)查統(tǒng)計人工穗芽的數(shù)目。穗芽的誘導過程見圖1。

圖1 柳枝稷人工穗芽培養(yǎng)Fig.1 Artificial ear buds formation of switchgrass

1.2.3 測定項目與方法 調(diào)查人工穗芽的增殖效率、生根率和幼苗移栽成活率。計算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

西稷1號、西稷2號和西稷3號3個基因型的外植體接種后誘導出幼穗的時間存在差異（表1），其中西稷1號和西稷3號誘導出幼穗的時間相同，但西稷2號則較西稷1號和西稷3號延長了2d，表明西稷2號的幼穗誘導周期較長。

不同基因型對柳枝稷幼穗的增殖效率存在差異，其中，西稷1號基因型的幼穗增殖效率最高，西稷2號幼穗增殖效率最低，西稷3號的幼穗增殖效率介于兩者之間。方差分析結(jié)果表明，西稷1號的增殖效率顯著高于西稷3號（P＜0.05），而極顯著高于西稷2號（P＜0.01），西稷2號和西稷3號之間的差異也達到極顯著水平（P＜0.01）。說明西稷1號為較理想的基因型，其次為西稷3號，而西稷2號基因型的增殖效果最差。

表1 基因型對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 1 Effects of genotype on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表2 幼穗長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 2 Effects of young panicle length on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.2 幼穗長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

選用西稷1號基因型的柳枝稷誘導穗芽，結(jié)果表明（表2），不同長度西稷1號基因型的幼穗對柳枝稷人工穗芽的增殖效率有很大的影響。隨著幼穗長度的增加，增殖效率呈先增后減的趨勢，而取長度為1.5 cm的幼穗時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為1 600.00%。方差分析表明，長度為1.5cm的幼穗增殖效率極顯著高于其他長度的幼穗（P＜0.01）。因此，選用西稷1號基因型長度為1.5cm的幼穗進行穗芽增殖較為理想。

2.3 生長激素配比對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

6－BA是一種高效的植物細胞分裂素，它調(diào)控細胞核基因的活性和蛋白質(zhì)的磷酸化與翻譯［19］。6－BA對西稷1號基因型柳枝稷的長度為1.5cm幼穗的穗芽增殖有明顯的促進作用，且其促進作用在6－BA濃度為3.0mg／L時達到最高，其后則呈減弱趨勢（表3）。適量2，4－D的加入，也會明顯增加柳枝稷的穗芽增殖效率。初始基本培養(yǎng)基中生長激素組合為3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為2 333.33%。經(jīng)方差分析，3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D激素組合與3.0mg／L 6－BA 和3.5mg／L 6－BA 的穗芽增殖效率差異不顯著，而顯著高于激素組合2.5 mg／L 6－BA＋0.15mg／L 2，4－D（P＜0.05），極顯著高于2.0mg／L 6－BA＋0.20mg／L 2，4－D（P＜0.01）。由于激素組合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D的穗芽增殖效率略高于生長激素3.0mg／L 6－BA，因此在西稷1號基因型柳枝稷穗芽再生體系后期試驗中采用激素組合3.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L 2，4－D。

2.4 初次切割時期穗芽長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在利用前期基因型、幼穗長度、生長激素試驗結(jié)果的基礎上，初次切割時穗芽的長度對柳枝稷穗芽增殖效率有著顯著的影響，且穗芽的增殖效率隨著初次切割時穗芽長度的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢（表4）。初次切割穗芽長1.5cm時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，達到2 433.33%。方差分析表明，初次切割長度為1.5cm時的穗芽增殖效率與長度為1.0，2.0和2.5 cm的穗芽增殖效率間的差異達到極顯著水平（P＜0.01）。因此，初次切割時期選擇穗芽長度1.5cm較為理想。

表3 生長激素對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 3 Effects of phytohormone on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.5 大量培養(yǎng)階段穗芽長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗結(jié)果的基礎上，大量培養(yǎng)階段穗芽長度對增殖效率有著顯著的影響，且穗芽的增殖效率隨著穗芽長度的增加呈現(xiàn)出先大幅升高其后則呈降低的趨勢（表5）。當穗芽長度為1.5cm時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，達到3 400.00%。方差分析表明，大量培養(yǎng)階段柳枝稷穗芽長度為1.5cm時分離，其穗芽增殖效率與長度為1.0，2.0和2.5cm的穗芽增殖效率間的差異達到極顯著水平（P＜0.01）。因此，大量培養(yǎng)階段穗芽長度選擇1.5cm進行增殖較為理想。

表4 初次切割時期穗芽長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 4 Effects of spike buds length of first cutting time on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.6 碳源對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

結(jié)合基因型、幼穗長度、生長激素、初次切割時期和大量培養(yǎng)階段穗芽長度試驗研究結(jié)果，培養(yǎng)基采用不同碳源對柳枝稷穗芽的增殖效率有顯著的影響，其中以麥芽糖作為碳源時柳枝稷穗芽的增殖效率最高，為3 633.33%（表6）。經(jīng)方差分析，麥芽糖、蔗糖和甘露醇3種碳源的培養(yǎng)基對柳枝稷穗芽增殖效率存在差異，其中碳源為麥芽糖的穗芽增殖效率顯著高于蔗糖（P＜0.05），且極顯著的高于甘露醇的穗芽增殖效率（P＜0.01），而碳源為蔗糖或甘露醇時兩者之間差異不顯著。因此在穗芽培養(yǎng)中選用麥芽糖作為碳源較為理想。

表5 大量培養(yǎng)階段穗芽長度對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 5 Effects of spike buds length of mass culturing stage on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

表6 碳源對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 6 Effects of carbon source on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.7 培養(yǎng)基pH值對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗結(jié)果的基礎上，培養(yǎng)基pH值對柳枝稷穗芽增殖效率有顯著影響，增殖效率隨著培養(yǎng)基pH值的升高呈現(xiàn)出先迅速升高后緩慢下降的趨勢（表7）。在培養(yǎng)基pH為5.8時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為3 766.67%。方差分析表明，培養(yǎng)基pH值為5.8時穗芽增殖效率與pH值6.0和6.2之間差異不顯著，而極顯著高于pH值為5.4和5.6時的穗芽增殖效率（P＜0.01）。因此，培養(yǎng)基pH值應控制在5.8～6.2時較理想，但以pH值為5.8時的增殖效率最好。

2.8 大量培養(yǎng)階段穗芽塊的切割方式對柳枝稷穗芽增殖效率的影響

在前期試驗研究結(jié)果的基礎上，切割方式采用縱切時，柳枝稷穗芽增殖效率最高，為4 166.67%（表8）。方差分析表明，采用縱切和橫切2種切割方式時，幼穗增殖效率之間差異達到極顯著水平（P＜0.01）。因此，叢生芽的切割方式以縱切最為理想。

表7 培養(yǎng)基pH對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 7 Effects of pH value on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

2.9 生根培養(yǎng)基對成苗的影響

良好的根系發(fā)育，是穗芽發(fā)育成苗乃至正常生長發(fā)育的基礎。利用基因型、幼穗長度、激素、初次切割時期、大量培養(yǎng)階段穗芽分離時期、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式試驗研究結(jié)果，選擇生長狀態(tài)一致的穗芽，分別轉(zhuǎn)至4種不同的生根培養(yǎng)基中，20d有不定根生成，45d后調(diào)查生根率。并將生好根的幼苗移栽至溫室，2周后調(diào)查成活率。結(jié)果表明（表9），采用1／2MS作為生根培養(yǎng)基時，柳枝稷的生根率和移栽成活率均達到最大。因此，采用1／2MS培養(yǎng)基作為生根培養(yǎng)基較為理想。

表8 穗芽的切割方式對柳枝稷穗芽增殖效率的影響Table 8 Effects of cutting way on spike buds proliferation efficiency of switchgrass

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)增殖效率受到外植體類型、培養(yǎng)方式、基本培養(yǎng)基、植物激素組合和濃度等的影響。而植物材料的基因型是影響植物叢生芽誘導的一個重要因素，一般情況下，同屬不同種之間叢生芽的再生率存在較大的差異，即使在同種不同品種間也有較大差異［20］。在本試驗中，筆者通過對柳枝稷3種基因型幼穗離體再生研究，發(fā)現(xiàn)西稷1號基因型穗芽的增殖效率最高，證明在柳枝稷穗芽增殖過程中存在基因型決定增殖效率的現(xiàn)象。

表9 生根培養(yǎng)基對幼苗移栽成活率的影響Table 9 Effects of rooting medium on transplanting survival rate of seedling

在植物組織培養(yǎng)中，植物的器官分化決定于植物體內(nèi)細胞分裂素和生長激素的比例，其中6－BA可以有效地誘導芽的萌發(fā)與不定芽的增殖，這是因為6－BA是一種高效的植物細胞分裂素，它調(diào)控細胞核基因的活性和蛋白質(zhì)的磷酸化與翻譯［21－23］。柳枝稷穗芽培養(yǎng)的成功與否也依賴于外源激素，6－BA和2，4－D在幼穗培養(yǎng)和穗芽組織塊形成中起著十分重要的作用。在本試驗中，以柳枝稷幼穗為外植體誘導穗芽的發(fā)生依賴于適宜濃度的6－BA，尤以6－BA 3.0mg／L為誘導培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基效果最好。這與在黑麥草（Loliumperenne）、早熟禾（Poa pratensis）、翠竹（Sasapygmaea）、大花蕙蘭（Cymbidium）等的研究結(jié)果相同［17，24－27］。另外，試驗中還發(fā)現(xiàn)，在柳枝稷穗芽誘導和增殖培養(yǎng)基中，少量2，4－D的加入會提高柳枝稷的穗芽增殖效率，且2，4－D濃度為0.10mg／L時最理想。

碳源是植物組織培養(yǎng)中重要的營養(yǎng)源，它不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。近年來，各種糖類對植物組織培養(yǎng)的效應，引起廣泛關(guān)注［28］。研究表明，不同植物對不同碳源種類的反應不完全相同［29］。在本試驗中，不同碳源對柳枝稷穗芽的增殖效率由高到低依次是麥芽糖＞蔗糖＞甘露醇，麥芽糖雖比蔗糖高，但麥芽糖與蔗糖相比價格昂貴，從試驗成本的因素來考慮采用蔗糖較為合適。

本試驗以柳枝稷幼穗為外植體，依次從基因型、幼穗長度、激素、初次切割時期、大量培養(yǎng)階段穗芽分離時期、碳源、pH值、穗芽塊的切割方式和生根培養(yǎng)基等9個方面對柳枝稷人工穗芽再生體系進行了優(yōu)化，初步建立起柳枝稷人工穗芽高效再生體系，該體系可用于柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化和細胞工程研究以及種質(zhì)保存和快速繁殖。此外，該體系具有試驗周期短、植株再生頻率高、基因型約束較小和取材不受季節(jié)限制等優(yōu)點。

本試驗中柳枝稷人工穗芽再生體系是通過單因素尋優(yōu)的方法獲得的，沒有綜合考慮各因素間的相互作用，因此，下一步試驗將采用正交旋轉(zhuǎn)回歸設計對初步獲得的再生體系進行優(yōu)化。

［1］侯新村，范希峰，武菊英，等.纖維素類能源草在京郊地區(qū)的經(jīng)濟效益與生態(tài)價值評價［J］.草業(yè)學報，2011，20（6）：12－17.

［2］陳序.能源牧草堪當未來生物能源之大任［J］.草業(yè)學報，2008，17（3）：1－5.

［3］Sanderson M A，Reed R L，Mclaughlin S B，etal.Switchgrass as a sustainable bioenergy crop［J］.Bioresource Technology，1996，56（1）：83－93.

［4］劉吉利，朱萬斌，謝光輝，等.能源作物柳枝稷研究進展［J］.草業(yè)學報，2009，18（3）：232－240.

［5］胡松梅，龔澤修，蔣道松.生物能源植物柳枝稷簡介［J］.草業(yè)科學，2008，25（6）：9－33.

［6］Porter C L.An analysis of variation between upland and lowland switchgrass（PanicumvirgatumL）［J］.Ecology，1966，47：980－992.

［7］Keshwani D R，Cheng J J.Switchgrass for bioethanol and other value－added applications：A review［J］.Bioresource Technology，2009，100：1515－1523.

［8］Mclaughlin S B，Kszos L A.Development of switchgrass as a bioenergy feedstock in the united states［J］.Biomass and Bioenergy，2005，28（6）：515－535.

［9］孟敏，李華軍，徐開杰，等.柳枝稷的組織培養(yǎng)技術(shù)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（4）：1477－1478.

［10］Jason N B，David G J，Blake L J，etal.An improved tissue culture system for embryogenic callus production and plant regeneration in switchgrass（PanicumvirgatumL.）［J］.Bioenergy Research，2009，2：267－274.

［11］劉芳，韋鵬霄，岑秀芬，等.外植體和基本培養(yǎng)基對臺灣金線蓮叢生芽誘導的影響［J］.北方園藝，2009，（4）：103－104.

［12］劉宣雨，劉樹君，宋松泉.建立甜高粱高頻、高效再生體系的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（23）：4963－4969.

［13］張杰，李和平，廖玉才，等.小麥莖尖叢生芽誘導及植株再生［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2010，29（4）：403－407.

［14］任振勝，卿冬進，李有志，等.雜交玉米的叢生芽的誘導植株再生和轉(zhuǎn)化［J］.分子植物育種，2007，5（3）：324－328.

［15］王娟.草地早熟禾高效叢生芽體系的建立［J］.草業(yè)與畜牧，2009，163（6）：42－45.

［16］Ganeshan S，Baga M，Harvey B L，etal.Production of multiple shoots from thidiazuron－treated mature embryos and leafbase／apical meristems of barley［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，73：57－64.

［17］劉珍，袁慶華，王瑜，等.多年生黑麥草高頻叢生芽增殖培養(yǎng)體系的研究［J］.草地學報，2010，18（4）：576－583.

［18］馮波，段嬌嬌，武國強，等.多漿旱生植物霸王高頻組培再生體系的建立［J］.草業(yè)學報，2010，19（6）：140－146.

［19］王兆龍，曹衛(wèi)星.細胞分裂素對植物基因表達的調(diào)節(jié)［J］.植物生理學通訊，2000，36（1）：82－88.

［20］李杰，黃敏仁，王明庥，等.大花蕙蘭不同基因型組培繁殖系數(shù)的差異［J］.南京林業(yè)大學學報，2005，29（1）：98－100.

［21］閆帆，孫昕，翟瑩，等.6－BA濃度及基因型對大豆胚尖誘導叢生芽的影響［J］.大豆科學，2011，30（1）：29－32.

［22］謝寅峰，張志敏，尚旭嵐，等.青錢柳莖段腋芽萌發(fā)和叢生芽增殖［J］.林業(yè)科學，2011，47（1）：50－55.

［23］張兆功，邵登魁，李莉，等.NAA、6－BA對不同熟性甘藍子葉期愈傷組織誘導的影響及其叢生芽發(fā)生［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20（1）：128－132.

［24］姜素云，胡哮瑞.黑麥草高效叢生芽的發(fā)生及離體開花的初步研究［J］.草業(yè)學報，2005，14（6）：100－106.

［25］楊愛芳，何春梅，王賢麗，等.黑麥草幼穗離體培養(yǎng)及植株再生［J］.草業(yè)學報，2004，13（5）：84－90.

［26］張春霞，羅仁祥.翠竹的組織培養(yǎng)和快速繁殖［J］.植物生理學通訊，2010，46（5）：477－478.

［27］汪金蘭，周輝明，羅慶國，等.6－BA、NAA不同配比對大花蕙蘭叢生芽增殖的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2009，1：85－86.

［28］Al－Khateed A A.Regulation of in vitro bud formation of date palm （PhoenixdactyliferaL.）cv.Khanezi by different carbon sources［J］.Bioresource Technology，2008，99：6550－6555.

［29］藍祖栽，黎穎菁，凌征柱，等.不同碳源對草珊瑚叢生芽誘導增殖的影響［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23（3）：6－7.