血清氨基酸和CEA/CA19-9聯(lián)合測定對結(jié)直腸癌診斷的價值

路麗娟，劉明浩，胡文煒，馬萍，王瑞玲

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是我國常見的消化道惡性腫瘤。近年來，隨著生活方式的變化和人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高。但現(xiàn)有的結(jié)直腸癌篩查方法的特異性和敏感性都比較低，且結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)——結(jié)直腸鏡加病理活檢為有創(chuàng)檢查，大多數(shù)無癥狀的潛在人群難以接受[1]。此外，如果受檢人群腸道準(zhǔn)備欠佳或醫(yī)生缺乏相應(yīng)的操作經(jīng)驗，結(jié)直腸鏡檢查也易出現(xiàn)漏診，據(jù)報道其漏診率可達(dá)5%[2]。因此，結(jié)直腸癌的早期非侵入性診斷是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。

代謝組學(xué)(metabolomics，MS)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，可以揭示脂質(zhì)、糖類、核苷酸、氨基酸等小分子物質(zhì)的代謝過程，有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)測和治療腫瘤的新物質(zhì)。氨基酸是構(gòu)成人體的基本物質(zhì)，廣泛地參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等的代謝過程，其在疾病的早期可能就已發(fā)生了顯著變化[3-4]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)是常用的氨基酸代謝檢測方法，它集中了高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性[5]。本研究利用LC-MS/MS對結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者的血液樣本進(jìn)行分析，以期發(fā)現(xiàn)可以早期預(yù)警結(jié)直腸癌的標(biāo)志物，從而為高危結(jié)直腸息肉患者制定合理的隨訪周期。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年8－12月于火箭軍總醫(yī)院消化內(nèi)科和肛腸外科確診的結(jié)直腸癌患者30例，男16例，女14例，年齡(60.6±11.8)歲；選擇同期結(jié)直腸腺瘤30例作為對照，男22例，女8例，年齡(60.1±12.2)歲。兩組年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。所有病例均行結(jié)直腸鏡檢查或手術(shù)切除治療，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：①有腹痛、便潛血陽性、便秘等下消化道癥狀，影像學(xué)提示結(jié)直腸壁增厚，腫瘤標(biāo)志物異常；②須行結(jié)直腸鏡或手術(shù)治療，但還未進(jìn)行手術(shù)治療者；③結(jié)直腸組織病理學(xué)確診為結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)[7]：①有其他部位腫瘤；②經(jīng)過放療、化療或手術(shù)治療的患者；③曾經(jīng)切除過腸道息肉；④有代謝系統(tǒng)疾?。虎萦衅渌c道疾??；⑥近期遭受過重大應(yīng)激反應(yīng)；⑦經(jīng)病理證實排除結(jié)直腸癌或結(jié)直腸腺瘤。本課題經(jīng)火箭軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，納入研究的結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液(MSLAB50AA-01)、衍生劑(MSLAB50AA-02)、蛋白沉淀劑(MSLAB50AA-03)、標(biāo)記緩沖液(MSLAB50AA-04)、流動相調(diào)節(jié)劑A(MSLAB50AA-05)、流動相調(diào)節(jié)劑B(MSLAB50AA-06)、質(zhì)譜用氨基酸檢測試劑盒(MSLAB50AA)購自北京生物質(zhì)譜有限公司。甲醇(A452-4)、乙腈(A998-4)購自美國Fisher公司，冷凍高速離心機(jī)(1424R/1524R)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)，戴安液相色譜儀(UltiMate3000)購自美國戴安公司)，MS質(zhì)譜(API 3200 Q TRAP)購自美國AB公司，羅氏602購自瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 受試者禁食12h，于上午空腹抽取肘靜脈血樣2管，每管3～5ml，置于肝素鋰抗凝管。一管混勻后30min內(nèi)離心分離血清并置于–80℃冰凍保存，用于測定氨基酸；另一管于2h內(nèi)送至檢驗科測定血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和糖類抗原CA19-9。

1.3.2 氨基酸測定 根據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法，共測定50種氨基酸及其衍生物的水平。測定步驟如下：取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液、待測樣本各50μl，加入50μl蛋白沉淀劑，混勻后13 200r/min冷凍離心4min；取上清10μl，加50μl標(biāo)記緩沖液混勻，瞬時離心，再次加入20μl衍生液混勻，瞬時離心，置于55℃恒溫衍生15min；樣本置冰箱冷卻，混勻，瞬時離心，取50μl上機(jī)檢測。每個樣品重復(fù)3次。

色譜條件：色譜柱MSLab45AA-C18(150.0mm×4.6mm，5μm)，柱溫50℃，流速1ml/min，流動相[A水相：水(1‰甲酸)；B有機(jī)相：乙腈(1‰甲酸)]0～37℃梯度洗脫，進(jìn)樣量5μl。

質(zhì)譜條件如下。離子源：+ESI電噴霧離子源；掃描方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；CUR：20psi(氣簾氣)；IS：+5500V(噴霧電壓)；CAD：Medium(碰撞氣)；CXP：2.0(碰撞室射出電壓)；GS1：55psi(霧化氣)；TEM：500℃(霧化溫度)；EP：10(射入電壓)；GS2：60psi(輔助氣)。

1.3.3 CEA/CA19-9測定 CEA和CA19-9由我院檢驗科技術(shù)人員采用電化學(xué)發(fā)光法測定。CA19-9正常值范圍0～37U/ml，CEA正常值范圍0～6.5ng/ml。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用二分類logistic回歸比較聯(lián)合檢測的診斷效能；采用Hanley和McNeil等[8]的方法比較受試者工作曲線(ROC)下面積。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清氨基酸和CEA、CA19-9測定結(jié)果 測定的50種氨基酸中，有5種氨基酸在結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。兩組CEA和CA19-9差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。29例結(jié)直腸腺瘤患者CEA/CA19-9正常，其中有1例患者同時存在CEA/CA19-9異常。結(jié)直腸腺癌中有20例CEA正常，26例CA19-9正常，其中2例患者同時存在CEA/CA19-9異常。

表1 兩組有差異的5種氨基酸及CEA/CA19-9檢測結(jié)果(±s，n=30)Tab.1 Diversely existed amino acids and CEA/CA19-9 results between the two groups (±s,n=30)

表1 兩組有差異的5種氨基酸及CEA/CA19-9檢測結(jié)果(±s，n=30)Tab.1 Diversely existed amino acids and CEA/CA19-9 results between the two groups (±s,n=30)

EtN.Ethanolamine; Cit.Citrulline; 5-HT.5-hydroxy tryptamine;Val.Valine; Leu.Leucine; CEA.Carcinoembryonic antigen

t P EtN (μmol/L) 8.73±3.35 10.94±5.00 –2.011 0.049 Cit (μmol/L) 42.88±16.47 54.74±18.77 –2.602 0.012 5-HT (μmol/L) 0.17±0.13 0.10±0.14 2.151 0.036 Val (μmol/L) 285.63±54.42 256.17±49.29 2.198 0.032 Leu (μmol/L) 140.41±34.38 122.03±33.17 2.107 0.039 CEA (ng/ml) 2.51±2.09 15.39±32.65 2.155 0.040 CA19-9 (U/ml) 11.66±9.92 25.27±27.18 2.577 0.014 Item Colorectal adenoma group Colorectal adenocarcinoma group

2.2 CEA/CA19-9聯(lián)合或不聯(lián)合5種氨基酸對結(jié)直腸癌診斷的預(yù)測價值 ROC曲線結(jié)果(圖1)顯示，聯(lián)合測定5種氨基酸和CEA/CA19-9對結(jié)直腸癌的診斷效果明顯優(yōu)于單獨測定CEA/CA19-9，兩者曲線下面積分別為0.908(95%CI：0.838～0.978)和0.791(95%CI：0.678～0.904)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)。聯(lián)合測定血清氨基酸和CEA/CA19-9診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性均明顯優(yōu)于單獨測定CEA/CA19-9(表2)。

圖1 CEA/CA19-9聯(lián)合或不聯(lián)合5種氨基酸對結(jié)直腸癌診斷價值的ROC曲線分析Fig.1 ROC curves of CEA/CA19-9 with or without 5 kinds of amino acids on the diagnosis of colorectal cancer

表2 CEA/CA19-9聯(lián)合或不聯(lián)合5種氨基酸對結(jié)直腸癌診斷的預(yù)測價值Tab.2 Predictive values of CEA/CA19-9 with or without 5 kinds of amino acids on the diagnosis of colorectal cancer

3 討 論

結(jié)直腸癌預(yù)后與早期診斷密切相關(guān)，大多數(shù)早期結(jié)直腸癌是可治愈的，5年生存率達(dá)90%，而晚期則不足10%[9]。因此，結(jié)直腸癌的早期診斷非常重要。自20世紀(jì)80年代我國就已開始重視結(jié)直腸癌的篩查，據(jù)報道通過普通篩查，可以使受檢人群結(jié)直腸癌的累積病死率下降14.7%[10]。指南推薦對于結(jié)直腸癌家族史不詳者于40歲進(jìn)行結(jié)直腸癌篩查，而無家族史者于50歲開始篩查，篩查終止于75歲[11]。對于篩查過程中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸息肉者，應(yīng)該結(jié)合我國國情以及患者血液腫瘤標(biāo)志物的動態(tài)變化制定合理的隨訪周期。結(jié)直腸腺瘤是結(jié)直腸癌的癌前病變，我國目前還沒有結(jié)直腸息肉切除術(shù)后結(jié)腸鏡隨訪周期的指南。無規(guī)律的隨訪時間不僅會造成患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、加重醫(yī)療壓力，同時也會導(dǎo)致部分癌變高危人群漏診。目前，隨著結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制研究的深入，盡早發(fā)現(xiàn)有價值的診斷性標(biāo)志物對于早期發(fā)現(xiàn)和診治結(jié)直腸癌、減輕社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)意義重大。

腫瘤患者代謝紊亂十分常見，但其機(jī)制研究甚少，腫瘤細(xì)胞能量代謝重編程是最新提出的腫瘤細(xì)胞特征[12]。有研究顯示，氨基酸代謝也參與了腫瘤細(xì)胞代謝過程，基于LC-MS/MS的氨基酸代謝組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)其代謝物質(zhì)的變化，以進(jìn)一步提高結(jié)直腸腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)率[5]。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是人體最豐富的非必需氨基酸，也是細(xì)胞培養(yǎng)基中不可或缺的成分，其廣泛參與三羧酸循環(huán)，為腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育提供氮源并參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)[13]。本研究雖然未在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸腺癌之間發(fā)現(xiàn)Gln濃度上的差異，但結(jié)直腸癌患者中Gln的濃度高于結(jié)直腸腺瘤[(524.93±118.74)vs.(546.10±70.12)]，說明癌癥患者存在對Gln的高需求。Li等[14]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)結(jié)直腸癌細(xì)胞系可過度表達(dá)磷酸絲氨酸磷酸酶(PSPH)，而后者可以調(diào)節(jié)絲氨酸(serine，Ser)和甘氨酸(glycine，Gly)的合成，并支持結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長。該研究還發(fā)現(xiàn)從飲食中剔除Ser和Gly，小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)展速度明顯減慢。本研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸腺瘤比較，結(jié)直腸癌中Ser和Gly的表達(dá)升高。但本研究中Gln、Ser、Gly在結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與納入的樣本數(shù)量有關(guān)系。Deng等[15]對美國印第安納州的結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸腺癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)酪氨酸(tyrosine，Tyr)、組氨酸(histidine，His)、Gly、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、Val等23種代謝產(chǎn)物的表達(dá)在兩組間有差異。本研究也發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸腺癌中Val水平存在明顯差異，提示Val將來很有可能應(yīng)用到臨床腫瘤標(biāo)志物中。兩項研究存在差異的原因可能是Deng等[15]納入的是歐美人群，與本研究納入的本國人群存在飲食、生活習(xí)慣、體型等方面的不同有關(guān)。

CEA是從結(jié)直腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)抗原，通常由中空的器官分泌，研究顯示其診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別是36%和87%[16]。糖類抗原CA19-9是一種黏蛋白型的糖蛋白腫瘤標(biāo)志物，在結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌中均可能升高，其診斷結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別為23%和96%[17]。本研究中將CEA與CA19-9聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌，發(fā)現(xiàn)其ROC曲線下面積為0.791，而Etn、Cit、5HT、Val、Leu與CEA/CA19-9聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積是0.908，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)。有文獻(xiàn)報道消化道腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以提高結(jié)直腸癌的發(fā)現(xiàn)率，但臨床上可預(yù)測結(jié)直腸癌的標(biāo)志物尚不足[18]。在臨床工作中，內(nèi)鏡醫(yī)師對于患有結(jié)直腸腺瘤性息肉的患者常會告知密切觀察，并根據(jù)結(jié)直腸息肉的數(shù)量、大小、病理類型等告知患者需要結(jié)直腸鏡隨訪的周期。目前隨訪周期均參考?xì)W美指南，對于息肉病理類型為高級別不典型增生、有絨毛成分，腺瘤直徑≥10mm或息肉數(shù)目＞3個，即判斷為高危人群，推薦3年后復(fù)查，其他低危險性息肉可以5～10年后復(fù)查[19-20]。Ewing等[21]報道結(jié)直腸癌的發(fā)生與多組基因突變密切相關(guān)，而基因突變必然會影響基因表達(dá)產(chǎn)物的變化，如果能測定這些表達(dá)產(chǎn)物，就可以發(fā)現(xiàn)易患癌癥的高危人群。目前，我國尚沒有結(jié)直腸息肉切除術(shù)后隨訪周期相關(guān)的共識意見及指南。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤與結(jié)直腸腺癌在氨基酸代謝產(chǎn)物及CEA、CA19-9的表達(dá)上存在差異，將來或許可以作為結(jié)直腸息肉切除后患者隨訪周期的一個參考指標(biāo)。對于上述標(biāo)志物表達(dá)正常的患者，可以適當(dāng)延長隨訪時間，而標(biāo)志物表達(dá)異常的患者，提示癌變概率增加，應(yīng)該縮短隨訪時間，以減少過多的檢查給患者帶來的風(fēng)險和經(jīng)濟(jì)壓力，并避免有惡變傾向的高危患者漏診。