基于ISSR標(biāo)記的南方紅豆杉野生種群和遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

李乃偉，賀善安，束曉春，汪 慶，夏 冰，彭 峰

〔江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

植物園以保存大量物種為特色，具有保存物種的“諾亞方舟”之美稱。在木本植物方面，其遷地保護(hù)種群規(guī)模較小，往往只有少數(shù)幾株，令人懷疑其在物種保護(hù)方面的實(shí)際作用與意義。從“最小有效種群”理論看，隨著時(shí)間的推移，這些小種群都會(huì)消亡［1-2］，所以，它們甚至被稱為“活著的死植物”［3-4］。應(yīng)該注意的是，這些理論和論斷的依據(jù)都是自然或野生狀態(tài)下小種群的動(dòng)態(tài)規(guī)律，對于引種到植物園里的小種群，在人為條件影響下，其動(dòng)態(tài)規(guī)律究竟如何則很少研究。李新華等［5］報(bào)道了在南京中山植物園內(nèi)引種栽培40余年后南方紅豆杉〔Taxus chinensis(Pilger) Rehd.var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu〕小種群的發(fā)展動(dòng)態(tài)，由11株南方紅豆杉組成的小種群，發(fā)展成1個(gè)具有400余植株的自然種群；在引種50余年后，該南方紅豆杉小種群繼續(xù)擴(kuò)展到600株以上［6］，南方紅豆杉小種群的這一發(fā)展動(dòng)態(tài)值得進(jìn)一步研究。本文旨在對南方紅豆杉小種群擴(kuò)展后其遺傳多樣性的變化進(jìn)行探討，為了更廣泛地研究南方紅豆杉小種群在植物園內(nèi)的動(dòng)態(tài)，筆者等又在廬山植物園找到了類似的種群，更豐富了研究的內(nèi)容。

種內(nèi)遺傳變異是物種適應(yīng)性變異或進(jìn)化的必要條件，對物種保護(hù)具有深遠(yuǎn)意義［7］。物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力既取決于種內(nèi)遺傳變異的大小，也有賴于遺傳變異的種群結(jié)構(gòu)［8-9］。遷地保護(hù)衍生種群和野生種群的遺傳多樣性研究具有重要的理論和實(shí)際意義，種群的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境［10］。

在南方紅豆杉這一引種實(shí)例中，小種群衍生出的自然種群個(gè)體越來越多，衍生種群的遺傳多樣性豐富度是否發(fā)生變化以及怎樣變化值得關(guān)注。為比較南方紅豆杉遷地保護(hù)栽培種群及其衍生種群與野生種群在遺傳多樣性上的差異，作者選取與廬山地處同一個(gè)山脈——幕阜山脈的江西修水縣黃沙鎮(zhèn)和黃港鎮(zhèn)的2個(gè)野生種群進(jìn)行比較，并選用幕阜山脈之外的福建楓溪野生種群作為外種群，采用ISSR標(biāo)記方法，比較了植物園次生林生境下南方紅豆杉遷地保護(hù)栽培種群和衍生種群與野生種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期為制定有效的瀕危植物保護(hù)措施提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2007年7月至9月，在福建楓溪鄉(xiāng)、江西黃沙鎮(zhèn)和江西黃港鎮(zhèn)分別選取3個(gè)南方紅豆杉野生種群，在廬山植物園和南京中山植物園分別選取2個(gè)遷地保護(hù)栽培種群以及2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群的實(shí)驗(yàn)材料，各種群的概況見表1。3個(gè)野生種群和廬山植物園遷地保護(hù)栽培種群各取19個(gè)單株(10雄9雌)；南京中山植物園和廬山植物園的遷地保護(hù)衍生種群各取19個(gè)單株(雌雄未分化)；南京中山植物園遷地保護(hù)栽培種群取8個(gè)單株(5雄3雌)，共計(jì)122個(gè)單株。在每一單株上取當(dāng)年生葉片，于硅膠中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)中使用的 d NTPs、10×PCR buffer及 Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司； DNA marker購自南京天為生物有限公司；瓊脂糖購自南京基威生物工程有限公司；所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取方法 取各單株的新鮮葉片，分別置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速磨成粉末，參照文獻(xiàn)［11］的改良CTAB法提取基因組總DNA，并置于-20℃條件下保存、備用。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增結(jié)果的檢測 擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積20μL，含25 ng模板DNA、2.0μL 10×PCR buffer、2.0μL 25 mmol·L-1MgCl2、0.15 μL 2.5 mmol·L-1d NTPs、0.6μL 10μmol·L-1引物和0.2 U Taq DNA聚合酶。

用PE 9800 PCR儀(美國GeneAmp公司)進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸80 s，共38個(gè)循環(huán)反應(yīng)；最后于72℃延伸5 min。

表1 供試的7個(gè)南方紅豆杉種群概況Table 1 Status of seven populations of Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以2 000 bp DNA marker為參照，EB染色。電泳結(jié)果用FR-200A凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)拍照。每個(gè)引物均重復(fù)擴(kuò)增2次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定的8個(gè)引物的清晰條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)位點(diǎn)上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。利用POPGENE version 1.31軟件［12］、參照文獻(xiàn)［13-14］的方法分析南方紅豆杉種群內(nèi)和種群間各遺傳多樣性和遺傳分化參數(shù)：多態(tài)性條帶百分率(PPB)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(h)、Shannon信息指數(shù)(I)和遺傳分化系數(shù)(GST)。

2 結(jié)果和分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果分析

7個(gè)南方紅豆杉種群的ISSR擴(kuò)增結(jié)果見表2。由表2可見，8個(gè)引物共擴(kuò)增出條帶73條，其中多態(tài)性條帶62條；平均每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為9.1條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)為7.8條。

表2 用于南方紅豆杉基因組總DNA ISSR標(biāo)記分析的引物序列及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primer sequences used for ISSR marker analysis of total genom ic DNA from Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei (Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu and am p lification results

2.2 基于ISSR標(biāo)記的南方紅豆杉種群的遺傳多樣性分析

采用ISSR標(biāo)記方法分析了7個(gè)南方紅豆杉種群的遺傳多樣性，相關(guān)參數(shù)見表3。7個(gè)南方紅豆杉種群中，2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群遺傳多樣性水平較高，其中南京中山植物園遷地保護(hù)衍生種群的多態(tài)性條帶百分率(PPB)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(h)和Shannon信息指數(shù)(I)值分別為64.38％、0.197 2和0.301 8；江西廬山植物園遷地保護(hù)衍生種群的PPB、h和I值分別為64.38％、0.189 5和0.291 1。江西黃港、江西黃沙和福建楓溪的3個(gè)野生種群的PPB、h和I值的總體水平居中，分別為57.53％～60.27％、0.148 3～0.188 3和0.233 8～0.283 1。相比之下，2個(gè)遷地保護(hù)栽培種群的遺傳多樣性水平較低，其中，南京中山植物園遷地保護(hù)栽培種群的PPB、h和I值分別為31.51％、0.107 8和0.161 3，江西廬山植物園遷地保護(hù)栽培種群的PPB、h和I值分別為56.16％、0.158 4和0.246 0。

表3 基于ISSR標(biāo)記分析的7個(gè)南方紅豆杉種群的遺傳多樣性分析Table 3 Analysis of genetic diversity of seven populations of Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu based on ISSR marker analysis

2.3 南方紅豆杉種群遺傳多樣性和遺傳分化分析

將南方紅豆杉的江西黃港種群(19個(gè)單株)、江西黃沙種群(19個(gè)單株)和福建楓溪種群(19個(gè)單株)3個(gè)野生種群合并作為1個(gè)野生種群(57個(gè)單株)，江西廬山和江蘇南京的遷地保護(hù)栽培種群合并作為1個(gè)遷地保護(hù)栽培種群(27個(gè)單株)，江西廬山和江蘇南京的遷地保護(hù)衍生種群合并作為1個(gè)遷地保護(hù)衍生種群(38個(gè)單株)，采用POPGENE軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。

合并后的南方紅豆杉野生種群、遷地保護(hù)栽培種群和遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性分析結(jié)果見表4。由表4可以看出，雖然3個(gè)野生種群以及2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群各自的遺傳多樣性參數(shù)值，即多態(tài)性條帶百分率(PPB)、Nei’s多樣性指數(shù)(h)和Shannon信息指數(shù)(I)差異較大，但合并后的野生種群和遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性參數(shù)值比較接近，前者的PPB、h和I值分別為82.19％、0.205 8和0.325 9，后者的PPB、h和I值分別為78.08％、0.207 6和0.322 9；而遷地保護(hù)栽培種群的遺傳多樣性參數(shù)值相對較小，PPB、h和I值分別為60.27％、0.180 7和0.275 2。

表4 南方紅豆杉野生種群、遷地保護(hù)栽培種群和遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性和遺傳分化參數(shù)Table 4 Genetic diversity and genetic differentiation parameters of w ild，ex-situ conservation cultivated and derived populations of Taxus chinensis(Pilger)Rehd.var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu

盡管合并后的南方紅豆杉野生種群與遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性參數(shù)值相對接近，但兩者的遺傳分化系數(shù)(GST)差異較大，遷地保護(hù)衍生種群的GST為0.068 9，明顯低于野生種群的GST(0.168 5)；而遷地保護(hù)栽培種群的遺傳分化系數(shù)最大(0.251 4)，明顯高于野生種群和遷地保護(hù)衍生種群。

3 討 論

3.1 南方紅豆杉3種種群的遺傳多樣性差異的比較

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，保護(hù)生物多樣性最終是要保護(hù)其遺傳多樣性，因?yàn)橐粋€(gè)物種的穩(wěn)定性和進(jìn)化潛力依賴其遺傳多樣性，而物種的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值也依賴其特有的基因組成［15］。

本研究結(jié)果表明，根據(jù)Nei’s多樣性指數(shù)(h)，將南方紅豆杉2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群和3個(gè)野生種群分別在種群水平上進(jìn)行分析，合并后的遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性與合并后的野生種群相近，單個(gè)遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性均較單個(gè)野生種群稍豐富，而合并后的或單個(gè)的遷地保護(hù)栽培種群的遺傳多樣性并不豐富。Shannon信息指數(shù)(I)同樣說明了這種差異，合并后的遷地保護(hù)衍生種群、野生種群和遷地保護(hù)栽培種群的I值分別為0.322 9、0.325 9和0.275 2。對7個(gè)種群遺傳多樣性的比較結(jié)果表明，南京中山植物園遷地保護(hù)栽培種群的遺傳多樣性顯著低于其他種群，其多態(tài)性條帶百分率(PPB)、h和I值分別僅為31.51％、0.107 8和0.161 3。

南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群與遷地保護(hù)栽培種群之間產(chǎn)生的遺傳多樣性差異可能與其基因突變和遺傳漂變有關(guān)，使得遷地保護(hù)衍生種群具有較高的遺傳多樣性。南京中山植物園的南方紅豆杉遷地保護(hù)栽培種群的遺傳多樣性指標(biāo)非常低，推測其原因有兩方面：首先，樣本數(shù)量較少，低于喬木遺傳多樣性分析所需的最低樣本數(shù)15，如果能夠達(dá)到廬山植物園遷地保護(hù)栽培種群的樣本數(shù)量，這2個(gè)種群的遺傳多樣性指數(shù)可能會(huì)比較接近；而如果南京中山植物園和廬山植物園南方紅豆杉的栽培數(shù)量再多一些，其遺傳多樣性指數(shù)可能也會(huì)接近野生種群。史全芬等［16］的研究結(jié)果表明，水杉(Metasequoia glyptostroboides Hu et W.C.Cheng)栽培種群的遺傳多樣性接近于野生種群，涵蓋了野生種群近80％的遺傳多樣性。第二，南京中山植物園最初引種11株南方紅豆杉，有3株在20世紀(jì)90年代死亡，但衍生種群中涵蓋了這3株個(gè)體的遺傳基因，這也可能會(huì)影響分析結(jié)果。

3.2 南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群與野生種群遺傳結(jié)構(gòu)的差異比較

植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)反映了進(jìn)化過程中的多種交互作用，如地理分布漂移、棲息地分裂、居群孤立、居群突變和基因漂變［17］。作者采用POPGENE軟件統(tǒng)計(jì)分析ISSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果，顯示出南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群與野生種群不同的遺傳結(jié)構(gòu)。3個(gè)野生種群的遺傳分化系數(shù)(0.168 5)接近于裸子植物的平均遺傳分化系數(shù)(0.18)［18-19］，而2個(gè)遷地保護(hù)衍生種群的遺傳分化系數(shù)(0.068 9)則非常低。紅豆杉科(Taxaceae)的北美紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)［20］、加拿大紅豆杉(T.canadensis Marsh.)［21］和穗花杉〔Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilg.〕［22］的野生種群的遺傳分化系數(shù)都非常高。以上比較結(jié)果說明，孤立生長在2個(gè)植物園內(nèi)的南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群與野生種群相比，前者種群間的遺傳變異小于后者，進(jìn)一步說明了植物園的“圈存”作用使遷地保護(hù)的植物種群更加孤立，增加了種群內(nèi)部的變異，遺傳漂變和基因突變的作用也更加明顯。

3.3 南方紅豆杉遷地保護(hù)的意義

遺傳變異的保存是保護(hù)瀕危物種的主要目的之一。種群內(nèi)和種群間遺傳變異的研究為瀕危物種保存過程中形成合理的管理策略提供了重要信息［23］。本研究結(jié)果可以為南方紅豆杉及紅豆杉科其他植物的遷地保護(hù)提供參考。近年來，為了得到紫杉醇而對紅豆杉科植物進(jìn)行的亂砍亂伐，已經(jīng)導(dǎo)致其瀕危［24］。種群規(guī)模的縮小很容易導(dǎo)致這些物種由于隨機(jī)的遺傳漂變和同系繁殖而遭受遺傳多態(tài)性喪失，保存這些瀕危植物使其長期生存已經(jīng)迫在眉睫。因此，南方紅豆杉的遷地保護(hù)栽培種群、遷地保護(hù)衍生種群和野生種群的遺傳結(jié)構(gòu)的比較研究對該物種的保護(hù)有著重要的意義。

本研究中，盡管南方紅豆杉遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性較低，但所形成的遷地保護(hù)衍生種群的遺傳多樣性卻出現(xiàn)了增加的趨勢，說明植物園的遷地保護(hù)作用不可忽視，并不像以往有些推論，只能成為“活著的死植物”。所以，遷地保護(hù)可以成為一種有效的保護(hù)形式。然而，植物園作為瀕危植物遷地保存的重要場所，應(yīng)有自然林和人工林相結(jié)合的特殊群落結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在能使11或29株母本植物繁殖后代形成一個(gè)具有豐富遺傳多樣性的天然種群。為使植物園保護(hù)的植物小種群能夠長久繁衍，在建立一個(gè)新的植物園之初，就應(yīng)考慮供游人參觀的開放區(qū)與供植物種群繁衍擴(kuò)張的自然區(qū)的結(jié)合。本文的研究結(jié)果對植物園的建園和管理策略提供了新的思考因素。

研究稀有物種或?yàn)l危物種種群的遺傳變異在形成保護(hù)策略中有重要作用［25］。研究種群存活能力的生態(tài)學(xué)家Franklin認(rèn)為，短期存活的有效種群大小不得低于50株［26］；還有理論認(rèn)為，采用遷地保護(hù)方式應(yīng)該盡可能多的采集樣本，如Lawrence認(rèn)為遷地保護(hù)策略中至少收集172株植物［27］，尤其應(yīng)采集遺傳多樣性較高的種群內(nèi)的樣本。但是，本研究結(jié)果表明，含有少數(shù)個(gè)體的、遺傳多樣性較低的遷地保護(hù)小種群在保護(hù)物種上也具有相當(dāng)重要的意義，其繁殖衍生出的新的自然小種群也有增加遺傳多樣性的可能。

目前，雖然南方紅豆杉遷地保護(hù)衍生種群還有進(jìn)一步擴(kuò)張的趨勢，但隨著時(shí)間的推移，南方紅豆杉個(gè)體之間是否會(huì)出現(xiàn)近親繁殖導(dǎo)致的遺傳退化，從而使衍生種群遺傳多樣性急劇降低進(jìn)而影響其存活能力，還需要進(jìn)一步研究。如果遷地保護(hù)衍生種群的后代種群不出現(xiàn)遺傳變異的喪失，仍然保持遺傳多樣性的增長趨勢，那么它們就能夠適應(yīng)環(huán)境的變化，容易存活下來進(jìn)而擴(kuò)展其分布范圍。

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