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    ‘孔府酥脆’棗試管苗離體葉片不定梢誘導(dǎo)和再生

    2011-12-31 13:50:18孫清榮孫洪雁周廣芳
    關(guān)鍵詞:孔府蔗糖生根

    孫清榮,孫洪雁,周廣芳

    (山東省果樹(shù)研究所,山東泰安271000)

    紅棗營(yíng)養(yǎng)豐富、富含維生素,深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài),但由于棗(Zizyphus jujuba Mill.)樹(shù)在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常受到細(xì)菌、真菌等病害的危害,制約了紅棗的產(chǎn)量。通過(guò)品種改良可以獲得優(yōu)良的棗樹(shù)品種,但由于棗胚敗育率高及落花落果嚴(yán)重等因素,導(dǎo)致利用常規(guī)雜交育種方法很難達(dá)到品種改良的目的?;蚬こ痰耐庠椿蜻z傳轉(zhuǎn)化技術(shù)為植物抗病品種的選育提供了育種新途徑,而遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的成功應(yīng)用則主要依賴于植物高效再生體系的建立。因此,建立棗樹(shù)的高效再生體系是實(shí)現(xiàn)其分子育種的首要步驟,對(duì)棗樹(shù)的品種選育至關(guān)重要。

    ‘孔府酥脆’棗(Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’)是優(yōu)良的鮮食棗品種之一,但該品種植株在種植過(guò)程中易感染棗瘋病,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量。有關(guān)棗及其不同品種離體葉片不定梢誘導(dǎo)的研究較多[1-5],但由于基因型的不同,這些研究成果均不適用于‘孔府酥脆’棗葉片不定梢再生。迄今為止,尚未見(jiàn)有關(guān)‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢再生方面的報(bào)道。作者研究了培養(yǎng)方法和外源植物激素添加量對(duì)‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢再生的影響,以期獲得‘孔府酥脆’棗葉片不定梢再生的最佳培養(yǎng)條件,為將抗棗瘋病基因轉(zhuǎn)入‘孔府酥脆’棗的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    實(shí)驗(yàn)用‘孔府酥脆’棗試管苗由作者所在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),在增殖培養(yǎng)基(含2 mg·L-1BA、0.4mg·L-1IBA、30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂的MS培養(yǎng)基,pH 5.8)上繼代保存約30 d。

    1.2 方法

    1.2.1 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇WPM培養(yǎng)基[6]為基本培養(yǎng)基,均含有30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂,并在滅菌前將培養(yǎng)基酸堿度調(diào)整至pH 5.8。根據(jù)添加植物激素的種類及質(zhì)量濃度分為2組培養(yǎng)基(Ⅰ和Ⅱ),分別用于愈傷組織誘導(dǎo)和不定梢誘導(dǎo)。培養(yǎng)基Ⅰ共6種,分別添加不同質(zhì)量濃度的TDZ(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和IAA(0.1、0.5 mg·L-1):Ⅰ1含0.1 mg·L-1TDZ和0.1 mg· L-1IAA;Ⅰ2含0.1 mg·L-1TDZ和0.5 mg·L-1IAA;Ⅰ3含0.5 mg·L-1TDZ和0.1 mg·L-1IAA;Ⅰ4含0.5 mg·L-1TDZ和0.5 mg·L-1IAA;Ⅰ5含1.0 mg·L-1TDZ和0.1 mg ·L-1IAA;Ⅰ6含1.0 mg·L-1TDZ和0.5 mg·L-1IAA。培養(yǎng)基Ⅱ共2種:Ⅱ1含0.1 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1GA3;Ⅱ2含0.5 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1GA3。

    1.2.2 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)流程的篩選 不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)基本流程為:從試管苗頂端摘取剛展開(kāi)的幼嫩葉片,將葉片垂直于中脈橫切后接種于培養(yǎng)基Ⅰ上,葉片近軸面接觸培養(yǎng)基;葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周。在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)條件為:暗培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(25±2)℃;在培養(yǎng)基Ⅱ上的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照時(shí)間為14 h·d-1,光照度為2 500 lx。

    為確定不同培養(yǎng)方法對(duì)不定梢誘導(dǎo)的影響,在上述基本培養(yǎng)流程的基礎(chǔ)上設(shè)置2種培養(yǎng)方式18種培養(yǎng)組合,分別為一步培養(yǎng)方式(在6種培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周)和兩步培養(yǎng)方式(在6種培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后再分別轉(zhuǎn)接到2種培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周)。另外,為研究愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定梢誘導(dǎo)的影響,對(duì)兩步培養(yǎng)方式中葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了不同的設(shè)置(分別為1、2、3和4周)。

    每處理接種3瓶,每瓶接種10個(gè)外植體,各處理均重復(fù)3次。在培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周后,記錄再生不定梢的葉片數(shù)并計(jì)算不定梢的誘導(dǎo)率,結(jié)果取平均值。

    1.2.3 不定梢的增殖和生根培養(yǎng) 將在培養(yǎng)基Ⅱ上獲得的不定梢(芽)轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基(含2.0 mg·L-1BA、0.4 mg· L-1IBA、30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂的MS培養(yǎng)基,pH 5.8)上進(jìn)行繼代和增殖培養(yǎng),待不定梢在增殖培養(yǎng)基上長(zhǎng)至1.5 cm以上時(shí)分別轉(zhuǎn)移至2組生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基分別為:含0.5 mg·L-1IBA、20 g·L-1蔗糖和6 g· L-1瓊脂的1/4MS培養(yǎng)基(pH 5.8);含0.5 mg·L-1IBA、30 g ·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂的1/4MS培養(yǎng)基(pH 5.8)。不定梢增殖和生根培養(yǎng)條件與不定梢誘導(dǎo)的光照培養(yǎng)條件相同。

    每處理4瓶,每瓶轉(zhuǎn)接15個(gè)不定梢,每處理重復(fù)3次,培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)生根的不定梢數(shù)量,計(jì)算生根率。生根率的計(jì)算公式為:生根率=(生根不定梢數(shù)/接種的不定梢總數(shù))×100%。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    采用DPSV3.01數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較,并對(duì)差異顯著性(P= 0.05)進(jìn)行檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 ‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)的3個(gè)影響因素分析

    采用不同的培養(yǎng)方式,‘孔府酥脆’棗葉片在激素配比不同的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間后不定梢的誘導(dǎo)率見(jiàn)表1。

    表1 培養(yǎng)方式、激素配比及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)率的影響(±SD)Table 1 Effects of culture method,phytohormone proportion and culture time on induction rate of adventitious shoot from leaves of Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’(±SD)

    表1 培養(yǎng)方式、激素配比及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)率的影響(±SD)Table 1 Effects of culture method,phytohormone proportion and culture time on induction rate of adventitious shoot from leaves of Zizyphus jujuba‘Kongfusucui’(±SD)

    1)Ⅰ1:0.1mg·L-1 TDZ-0.1 mg·L-1 IAA;Ⅰ2:0.1mg·L-1 TDZ-0.5 mg·L-1 IAA;Ⅰ3:0.5 mg·L-1 TDZ-0.1 mg·L-1 IAA;Ⅰ4:0.5 mg·L-1 TDZ-0.5 mg·L-1 IAA;Ⅰ5:1.0 mg·L-1 TDZ-0.1 mg·L-1 IAA;Ⅰ6:1.0 mg·L-1 TDZ-0.5 mg·L-1 IAA;Ⅱ1:0.1 mg·L-1 IAA-1.0 mg·L-1 GA3;Ⅱ2:0.5 mg ·L-1 IAA-1.0 mg·L-1 GA3.2)數(shù)據(jù)為葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周或分別培養(yǎng)1、2、3或4周后再轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)3周后的不定梢誘導(dǎo)率 These data indicate induction rate of adventitious shoot from leaves cultured continuously onmediumⅠfor seven weeks,or cultured onmediumⅠfor one,two,three or four weeks,respectively and then cultured on mediumⅡfor three weeks;同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference(P<0.05).

    培養(yǎng)方式1) Culture method1)不同培養(yǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)率/%2) Induction rate at different culture times2) 1周One week 2周Two weeks 3周Three weeks 4周Four weeksⅠ1 0.0gⅠ1-Ⅱ1 4.6±1.2e 6.0±1.3d 18.8±6.2cd 39.5±4.3fⅠ1-Ⅱ2 4.9±1.8e 6.1±0.9d 18.2±4.2d 40.2±3.7fⅠ2 0.0gⅠ2-Ⅱ1 15.7±2.5d 18.3±2.5c 25.2±1.9abcd 48.0±3.3eⅠ2-Ⅱ2 27.3±2.5ab 30.1±3.2a 29.7±3.5ab 49.0±3.3eⅠ3 0.0gⅠ3-Ⅱ1 5.0±2.6e 7.3±3.1d 23.7±4.0bcd 58.0±2.2dⅠ3-Ⅱ2 9.6±3.1e 10.9±2.0d 26.3±3.0abc 58.6±3.3dⅠ4 0.0gⅠ4-Ⅱ1 29.3±4.0a 30.3±2.5a 31.7±1.5a 65.2±3.5cⅠ4-Ⅱ2 15.7±3.8d 18.3±3.8c 25.1±4.9abcd 68.2±2.6cⅠ5 0.0gⅠ5-Ⅱ1 9.3±3.5e 10.6±2.7d 28.1±1.6ab 81.6±1.7bⅠ5-Ⅱ2 20.3±4.0cd 21.0±4.4bc 28.3±4.1ab 82.8±3.0bⅠ6 0.0gⅠ6-Ⅱ1 25.3±4.5abc 28.7±3.2a 29.9±4.6ab 88.5±1.3aⅠ6-Ⅱ2 23.3±3.5abc 25.3±4.7ab 27.8±5.2ab 86.2±2.2ab

    2.1.1 培養(yǎng)方式的影響 由表1可見(jiàn),采用一步培養(yǎng)法在6種培養(yǎng)基Ⅰ上連續(xù)培養(yǎng)7周后葉片均沒(méi)有分化出不定芽,僅能產(chǎn)生由黃白色變?yōu)楹稚挠鷤M織;而采用兩步培養(yǎng)法,將在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)不同時(shí)間的外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上后,所有處理組都能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定梢,但各處理組不定梢的誘導(dǎo)率不同。說(shuō)明兩步培養(yǎng)法對(duì)‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)是有效的。2.1.2 培養(yǎng)基中激素配比的影響 由表1還可見(jiàn),葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周后,培養(yǎng)基Ⅰ中TDZ的質(zhì)量濃度對(duì)不定梢的誘導(dǎo)率有顯著影響,隨著TDZ質(zhì)量濃度提高,不定梢的誘導(dǎo)率顯著增加。培養(yǎng)基Ⅰ中生長(zhǎng)素IAA的質(zhì)量濃度對(duì)葉片不定梢的誘導(dǎo)率也有明顯影響,在TDZ質(zhì)量濃度較低(0.1和0.5 mg·L-1)的培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1IAA,不定梢的誘導(dǎo)率顯著高于添加0.1mg·L-1IAA的培養(yǎng)基;但在TDZ質(zhì)量濃度較高(1.0 mg·L-1)的培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的IAA,不定梢誘導(dǎo)率的差異不大。

    培養(yǎng)基Ⅱ中IAA的質(zhì)量濃度對(duì)提高不定梢誘導(dǎo)率基本沒(méi)有作用,但對(duì)不定梢的生長(zhǎng)勢(shì)有一定影響。在添加了0.5 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基Ⅱ上誘導(dǎo)培養(yǎng)比在含0.1 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基Ⅱ上更有利于不定梢的伸長(zhǎng)生長(zhǎng),這可能與一定濃度的生長(zhǎng)素具有促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、刺激生長(zhǎng)的功能有關(guān)[7-8]。

    2.1.3 在培養(yǎng)基Ⅰ上不同培養(yǎng)時(shí)間的影響 由表1可見(jiàn),葉片在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)1、2或3周后再轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng),不定梢的誘導(dǎo)率均較低,絕大部分處理組的不定梢誘導(dǎo)率都在30%以下;而在培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)4周的葉片不定梢的誘導(dǎo)率則大幅度提高,表明適當(dāng)延長(zhǎng)在培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定梢誘導(dǎo)率的提高有一定作用。另外,為明確TDZ在‘孔府酥脆’棗葉片不定梢誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的作用,作者還將葉片在含1.0 mg·L-1TDZ的培養(yǎng)基Ⅰ上的培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至3個(gè)月和4個(gè)月,均沒(méi)有觀察到不定芽形成,但將葉片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)1周后即可觀察到不定梢,轉(zhuǎn)接2周后不定梢的誘導(dǎo)率可達(dá)60%以上,說(shuō)明培養(yǎng)基Ⅱ與‘孔府酥脆’棗葉片不定芽分化啟動(dòng)有關(guān)。

    2.2 不定梢的增殖和生根

    將獲得的不定梢轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),不定梢的增殖生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)狀況均較良好,月增殖倍數(shù)約為3。生根培養(yǎng)基中其他成分保持一致,分別添加30和20 g·L-1蔗糖,不定梢的生根率分別為89.9%和81.4%,每株生根數(shù)分別為2.8和2.3,顯示生根培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度對(duì)不定梢的生根有顯著影響,較高的蔗糖濃度有利于不定梢生根。

    3 討論和結(jié)論

    雖然棗樹(shù)葉片不定梢誘導(dǎo)已在一些品種或類型上獲得了成功[1-4,9-10],但因基因型的不同,所采用的不定梢誘導(dǎo)方法也有所不同,獲得的再生率也各不相同。陳宗禮等[1]以MS為基本培養(yǎng)基,采用兩步培養(yǎng)方法獲得了‘沾化冬棗’不定梢,不定梢的再生率為40%;而Gu等[2]以WPM為基本培養(yǎng)基,采用一步培養(yǎng)方法使‘沾化冬棗’不定梢再生率最高可達(dá)89.5%;以MS為基本培養(yǎng)基,采用兩步培養(yǎng)方法獲得的‘黃驊冬棗’不定梢的再生率達(dá)92.5%[3];而以WPM為基本培養(yǎng)基,采用兩步培養(yǎng)方法獲得的酸棗不定梢的再生率為100%[4-5];通過(guò)先誘導(dǎo)葉片不定根,再由不定根誘導(dǎo)不定芽也成功獲得了‘贊皇大棗’不定梢植株,但再生率很低,在20%以下[9]。這些結(jié)果均表明,基因型和培養(yǎng)方法對(duì)棗樹(shù)葉片不定梢的再生都有重要影響。本研究中,采用兩步培養(yǎng)法的‘孔府酥脆’棗葉片不定梢的再生率較高,與已報(bào)道的能獲得較高不定梢再生率的兩步培養(yǎng)方法相似[3-5],都在含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定的時(shí)間,然后轉(zhuǎn)接至含生長(zhǎng)素和赤霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

    綜合考慮不定梢誘導(dǎo)率及其生長(zhǎng)勢(shì),確定‘孔府酥脆’棗離體葉片不定梢誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)方法為采用兩種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基Ⅰ和培養(yǎng)基Ⅱ)的兩步培養(yǎng)法。其中,最佳培養(yǎng)基Ⅰ為含1.0 mg·L-1TDZ和0.5 mg·L-1IAA的WPM培養(yǎng)基,最佳培養(yǎng)基Ⅱ?yàn)楹?.5 mg·L-1IAA和1.0 mg·L-1GA3的WPM培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為‘孔府酥脆’棗的工廠化育苗及采用生物技術(shù)手段改良品種提供了技術(shù)基礎(chǔ)。這一培養(yǎng)方法也為不同棗品種葉片的不定梢誘導(dǎo)提供了參考依據(jù)。

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