崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的觀察和核型分析

周永剛,張冬梅,魯 琳,羅玉蘭,卞黎霞

崇明水仙為石蒜科 (Am aryllidaceae)水仙屬(NarcissusL.)多年生草本植物,屬于中國水仙的 1個(gè)栽培類型,與漳州水仙和普陀水仙統(tǒng)稱為中國水仙(N.tazettaL.var.chinensisRoem.),在上海市崇明縣已有 400年以上的栽培歷史。崇明水仙具有花香幽雅、水養(yǎng)期和花期長(zhǎng)等特點(diǎn),其重瓣花型以濃郁芳香著稱于國內(nèi)外花卉市場(chǎng),可與英國玫瑰齊名。目前,崇明水仙的栽培品種很少,且品種混雜,加之品種資質(zhì)退化、品質(zhì)下降及病毒病發(fā)生等因素的影響,已處于幾近滅絕邊緣。2007年,上海市將崇明水仙列入專項(xiàng)拯救計(jì)劃。然而,目前還沒有關(guān)于崇明水仙遺傳背景的系統(tǒng)研究和報(bào)道。

對(duì)水仙細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行分析是明確其種及品種間差別的基礎(chǔ)。栗田正秀[1]、Kam ae[2]和陳曉靜[3]先后進(jìn)行了關(guān)于中國水仙核型的研究,均認(rèn)為中國水仙是同源三倍體 (2n=3x=30)；然而,王瑞等[4]以漳州單瓣花水仙為材料得出的研究結(jié)果則有所不同,確定漳州單瓣花水仙的體細(xì)胞染色體呈三倍體趨勢(shì),但其核型卻顯示出異源三倍體的傾向。在水仙的細(xì)胞學(xué)研究方面,李懋學(xué)等[5]于 1980年對(duì)漳州、舟山和崇明3個(gè)產(chǎn)地的水仙進(jìn)行了染色體組型和 Giem sa C-帶帶型的比較研究,但并沒有發(fā)現(xiàn)品種間的明確差異。目前,有關(guān)崇明水仙不同類型的核型還未見系統(tǒng)的研究報(bào)道。

作者對(duì)崇明水仙細(xì)胞學(xué)研究的前處理溶液 (對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉水溶液)及前處理時(shí)間 (8、10、12和 14 h)進(jìn)行了篩選,并在細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體數(shù)、核型及倍性等進(jìn)行了比較分析,以期為崇明水仙優(yōu)質(zhì)種源的確定、莖和花型的改良、花期的調(diào)控、切實(shí)可行的栽培保種措施的制定及其推廣和應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的重瓣花型和單瓣花型崇明水仙鱗球均來源于上海市崇明縣百葉水仙花專業(yè)合作社二基地。

1.2 方法

1.2.1 前處理液及前處理時(shí)間的篩選 選取健康、直徑 8 cm的 3年生水仙商品球鱗球,每種花型 10個(gè),經(jīng)低溫處理解除休眠后,剝?nèi)ネ鈱雍稚母善つ?洗凈后置于培養(yǎng)皿中水培,每天換水 1～2次；經(jīng) 3～5 d培養(yǎng),待根尖長(zhǎng)至 0.5～1.0 cm時(shí),在上午 9：00至 10：00時(shí)采集根尖備用。

分別用對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002 mo l·L-18-羥基喹啉水溶液對(duì)根尖進(jìn)行前處理,浸泡時(shí)間設(shè)置 4個(gè)梯度(8、10、12和 14 h),每個(gè)時(shí)間梯度重復(fù)3次。將經(jīng)過前處理的根尖用蒸餾水清洗后置于卡諾固定液〔V(無水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1〕中固定 24 h；再轉(zhuǎn)入 1mo l·L-1HC l溶液中于 60℃恒溫條件下解離 7m in,水洗后用改良石炭酸品紅染色并壓片；采用冰凍法揭片,待干燥后用中性樹膠封片[6]。使用LeicaDM 2000-4N30系統(tǒng)生物顯微鏡(德國萊卡公司生產(chǎn))觀察各處理的細(xì)胞分裂情況并計(jì)算分裂指數(shù),從而篩選出適宜的前處理液和前處理時(shí)間。

1.2.2 根尖染色體壓片及觀察 根據(jù)上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)根尖進(jìn)行前處理并按照上述實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行制片和觀察。使用Leica DM 2000-4N 30系統(tǒng)生物顯微鏡進(jìn)行觀察,每種花型各選擇 50個(gè)染色體清晰、分散良好的中期分裂相進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)和拍照。采用Adobe Photoshop CS 8.0.1圖像處理軟件編輯后,各選取 10張照片按李懋學(xué)等[7]的方法進(jìn)行染色體核型分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及計(jì)算

分裂指數(shù) =(中期細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))× 100％。染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)（index of relative length,I.R.L)組成按照 Kuo等的方法[8]進(jìn)行分析,染色體相對(duì)長(zhǎng)度計(jì)算公式為：I.R.L=(染色體長(zhǎng)度/全組染色體總長(zhǎng)度)×100％；臂比計(jì)算公式為：臂比=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度 /短臂長(zhǎng)度；按照 Stebbins的標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行核型分類；核型不對(duì)稱系數(shù) (asymm etrical karyotype coefficient,A s.k)按照 A rano的方法[10]計(jì)算,計(jì)算公式為：A s.k=(長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng))×100％。

2 結(jié)果和分析

2.1 適宜的前處理液和前處理時(shí)間

為提高崇明水仙根尖體細(xì)胞中期細(xì)胞的分裂指數(shù),采用對(duì)二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉溶液這 2種常用于植物染色體的前處理液對(duì)根尖進(jìn)行預(yù)處理,并分別設(shè)置了 8、10、12和 14 h的前處理時(shí)間。結(jié)果表明 (表 1)：采用不同的前處理液進(jìn)行前處理,崇明水仙根尖所需的前處理時(shí)間不同；對(duì)二氯苯飽和溶液的前處理效果優(yōu)于 0.002 mol· L-18-羥基喹啉溶液,染色體處于分裂中期的細(xì)胞數(shù)較多,分裂指數(shù)最高可達(dá) 7.21％,且染色體容易分散、結(jié)構(gòu)比較清晰。因此,適宜于崇明水仙細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的前處理液為對(duì)二氯苯飽和溶液,最佳前處理時(shí)間為12 h。

2.2 染色體數(shù)及倍性分析

對(duì)重瓣花型和單瓣花型崇明水仙各 50個(gè)根尖細(xì)胞的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),結(jié)果表明：重瓣花型有 46個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)為 30,占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的92％；單瓣花型有 48個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)為 30,占計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的 96％。由圖 1可見：根據(jù)染色體的形態(tài)、長(zhǎng)度和長(zhǎng)短臂比,重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞的 30條染色體都可以按照每組 3條匹配為 10組,故推測(cè)它們都是 x=10的三倍體。因此,確定崇明水仙體細(xì)胞的染色體數(shù)為 2n=3x=30。

表 1 前處理液和前處理時(shí)間對(duì)崇明水仙根尖體細(xì)胞中期細(xì)胞分裂指數(shù)的影響Tab le 1 Effec t of p re-trea tm en t so lu tion and tim e on d iv ision index ofm etaphase cell in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus (N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

圖 1 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體形態(tài)Fig.1 Chrom osom em orpho logy in som a tic cellsof root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

2.3 染色體核型分析

2.3.1 重瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據(jù)根尖體細(xì)胞染色體的配對(duì)結(jié)果對(duì)重瓣花型崇明水仙的染色體核型參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見表 2；根據(jù)表 2數(shù)據(jù)繪制的染色體核型模式圖見圖 2。

表 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型參數(shù)1)Tab le 2 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le flower type of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

圖 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型模式圖F ig.2 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of doub le flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

在 10組染色體中,第 3、6、7、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；在第 7號(hào)染色體上有隨體,隨體長(zhǎng)度為 0.49μm。染色體組總長(zhǎng)度為40.47μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng)度為 30.95μm,平均長(zhǎng)度為4.05μm。在 10組染色體中第 1號(hào)染色體的總長(zhǎng)度最長(zhǎng),為 6.20μm；第 10號(hào)染色體最短,為 2.00μm；最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值為 3.10。核型不對(duì)稱系數(shù)(A s.k)為 76.48％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為2n=30=12L+6M2+12S。分析結(jié)果顯示：重瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型公式為 2n=3x= 30=15st+15sm(3SAT)。

由表 2還可看出：重瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的臂比變化范圍為 1.89～4.71,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據(jù) Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn),重瓣花型崇明水仙的體細(xì)胞的染色體核型屬于“3B”型。

2.3.2 單瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據(jù)根尖體細(xì)胞染色體的配對(duì)結(jié)果對(duì)單瓣花型崇明水仙的染色體核型參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見表 3；根據(jù)表3數(shù)據(jù)繪制的染色體核型模式圖見圖 3。

表 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型參數(shù)1)Tab le 3 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of single flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；在第 7號(hào)染色體上有隨體,隨體長(zhǎng)度為 0.52μm；染色體組總長(zhǎng)度為42.13μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng) 32.32μm,平均長(zhǎng)度 4.21μm。在10組染色體中第1號(hào)染色體的總長(zhǎng)度最長(zhǎng),為 6.58μm；第 10號(hào)染色體最短,為 2.06μm；最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值為 3.19。核型不對(duì)稱系數(shù)(A s.k)為 76.71％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為 2n=30= 12L+3M1+3M2+12S。分析結(jié)果顯示：?jiǎn)伟昊ㄐ统缑魉筛怏w細(xì)胞染色體的核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

圖 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型模式圖F ig.3 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of sing le flower type of Chongm ing na rc issus(N a rcissus tazetta L. var.ch inensis Roem.)

由表 3還可以看出：?jiǎn)伟昊ㄐ统缑魉筛怏w細(xì)胞染色體的臂比變化范圍為 1.72～5.02,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據(jù)Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn),單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型屬于“3B”型。

2.3.3 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體平均核型分析 根據(jù)上述觀察和測(cè)量結(jié)果可見：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙的根尖體細(xì)胞染色體核型間的差異不明顯,將二者的核型參數(shù)進(jìn)行平均分析得到的結(jié)果見表 4,根據(jù)平均核型參數(shù)繪制的平均核型模式圖見圖4。

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號(hào)染色體為近中部著絲點(diǎn)染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點(diǎn)染色體(臂比大于 3)；第 7號(hào)染色體具有隨體。染色體組總長(zhǎng)度 41.28μm；長(zhǎng)臂總長(zhǎng) 31.61μm,平均長(zhǎng)度 4.13μm。核型不對(duì)稱系數(shù) (A s.k)為76.57％,相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)組成為 2n=30=12L+6M2+ 12S。分析結(jié)果顯示：崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

由表 4還可以看出：崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體中臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的90％。根據(jù) Stebbins的核型分類標(biāo)準(zhǔn),崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型屬于“3B”型。

表 4 崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的平均核型參數(shù)1)Tab le 4 Average karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)1)

圖 4 崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體平均核型模式圖F ig.4 Average karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roo t-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)

2.3.4 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體核型的比較分析 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型參數(shù)的比較結(jié)果見表 5。結(jié)果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體的核型略有差異。相同點(diǎn)為：都屬于典型不對(duì)稱的二型核型,染色體數(shù)和倍性相同,核型類型同屬于“3B”型,隨體均出現(xiàn)在第 7號(hào)染色體的短臂上,臂比大于 2的染色體組數(shù)占全部染色體組的 90％。差異在于：重瓣花型的第 7號(hào)染色體為 sm型、第 8號(hào)為 st型,而單瓣花型的第 7號(hào)染色體為 st型、第 8號(hào)為 sm型；前者的核型不對(duì)稱系數(shù)(A s.k)略小于后者；前者的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為 12L+6M2+12S,后者的相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為 12L +3M1+3M2+12S；前者的最長(zhǎng)染色體與最短染色體長(zhǎng)度的比值略小于后者。綜合李懋學(xué)等[5]的研究結(jié)果,可以認(rèn)為重瓣花型和單瓣花型崇明水仙具有同一起源,二者在形態(tài)特征方面的差異可能是長(zhǎng)期進(jìn)行無性繁殖和栽培選擇所形成的基因型和生態(tài)型的差異。

表 5 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞染色體核型參數(shù)的比較1)Tab le 5 Com par ison of karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

3 討論和結(jié)論

在植物細(xì)胞染色體核型分析過程中,前處理過程是使細(xì)胞分裂停止在中期階段而獲得較多中期分裂相的關(guān)鍵步驟,前處理同時(shí)還可以使染色體縮短變粗,便于觀察和統(tǒng)計(jì)。在本實(shí)驗(yàn)過程中,針對(duì)不同類型水仙,前處理液和前處理時(shí)間有一定差異。前處理時(shí)間過短,染色體大部分還處于染色質(zhì)狀態(tài),得不到清晰可見的染色體；前處理時(shí)間過長(zhǎng),造成染色體過度縮短,無法判別著絲點(diǎn),也無法體現(xiàn)各染色體之間的差異,不能進(jìn)行準(zhǔn)確的核型分析。本實(shí)驗(yàn)中,在染色體制片過程中利用對(duì)二氯苯飽和溶液前處理 12 h,能夠獲得較多的中期分裂相細(xì)胞。但在 50個(gè)中期分裂相細(xì)胞中,能夠清晰鑒別出具有 30條染色體數(shù)的細(xì)胞數(shù)未達(dá)到 100％,這可能是由于在染色體制片過程中出現(xiàn)重疊或斷裂所致。

核型分析結(jié)果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細(xì)胞的染色體核型基本一致,差異較小。染色體數(shù)都為 2n=3x=30,其中包括 18條長(zhǎng)染色體和12條短染色體,短染色體中有 3條具隨體,按照染色體長(zhǎng)短和隨體染色體數(shù)目進(jìn)行配對(duì)可以配成 10組,平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。根據(jù)現(xiàn)有研究資料可以確定崇明水仙是三倍體植物。

水仙屬植物染色體數(shù)目和倍性變化復(fù)雜：染色體基數(shù)(x)有 7、10和 11三類；除二倍體外,還存在三倍體、四倍體和六倍體；染色體數(shù)從 14～56不等[11-13]。通過細(xì)胞學(xué)觀察,一些學(xué)者認(rèn)為中國水仙是三倍體植物[1,5],但是也有學(xué)者持不同觀點(diǎn)。曾滄江等[14]認(rèn)為中國水仙是二倍體植物；李懋學(xué)等[5]發(fā)現(xiàn)崇明水仙的染色體數(shù)目 2n=30,并據(jù)此推斷崇明水仙為同源三倍體植物。與王瑞[15]報(bào)道的漳州水仙染色體核型相比,崇明水仙的 10組染色體組中有多組出現(xiàn) 3條染色體中 2條體積形態(tài)相似并與另外一條形態(tài)差異較大的現(xiàn)象,尤其是第 7組具隨體的 3條染色體,其中的 2條無論是長(zhǎng)度、臂比還是隨體長(zhǎng)度都相似,而第 3條則隨體明顯,且染色體長(zhǎng)度在 3條染色體中最短。因此,初步推測(cè)崇明水仙是節(jié)段異源三倍體。這一結(jié)果與朱心武等[16]、莊偉建等[17]和李廣蘋[18]的研究結(jié)果一致。至于這種核型差異究竟是同源三倍體染色體之間的雜合現(xiàn)象,還是節(jié)段異源三倍體之間的差別,需要通過分子原位雜交和分子標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

由于長(zhǎng)期以來一直進(jìn)行無性繁殖,因此水仙的后代性狀相對(duì)穩(wěn)定。重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細(xì)胞染色體的核型差異較小,但在形態(tài)特征方面則表現(xiàn)出一定的差異,這可能與不同生態(tài)型的差異有關(guān)。從不同生態(tài)型的崇明水仙中選擇形態(tài)性狀較好的類型作為優(yōu)質(zhì)種源進(jìn)行迅速繁殖推廣,可達(dá)到對(duì)崇明水仙種源進(jìn)行提純、復(fù)壯和保種的目的,具有重要理論意義。

三倍體植物屬于多倍體范疇,多倍體特性不僅體現(xiàn)在植株速生和營養(yǎng)物質(zhì)增多上,還體現(xiàn)在植株的生態(tài)適應(yīng)性及抗逆性增強(qiáng)等方面[19]。從長(zhǎng)期的栽培歷史來看,崇明水仙具有球莖緊實(shí)、水養(yǎng)期及花期長(zhǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、對(duì) SO2和 CO有較強(qiáng)抗性等特性,在形態(tài)和生理上初步顯示出多倍體的物種優(yōu)勢(shì)。目前,利用秋水仙素處理植物組織器官[20]以及原生質(zhì)體融合技術(shù)在多倍體育種上都取得顯著效果[21]。多倍體育種可增加原細(xì)胞型不具有的新特性[22],可使花卉的花器官增大、色彩更艷麗或花期延長(zhǎng)[23]。綜上所述,基于崇明水仙所具有的三倍體遺傳背景,對(duì)崇明水仙進(jìn)行倍性改良具有很大的應(yīng)用潛力。然而,由于崇明水仙鱗莖小、少側(cè)腳、葉片較小、花多獨(dú)枝且不易造型,因此,可以考慮采用秋水仙素處理使染色體加倍的方法誘導(dǎo)崇明水仙產(chǎn)生突變,以獲得鱗莖增大、側(cè)腳和花枝增多、花器官增大的崇明水仙品種。

不同植物都有自身最適宜的染色體倍性水平,并不是染色體數(shù)越多、倍性越高越佳。如果超過了一定的倍性限度,就會(huì)破壞植物的遺傳平衡和生理平衡,從而導(dǎo)致許多缺陷的產(chǎn)生,尤其在同源多倍體中這一現(xiàn)象更為突出。中國水仙是異源三倍體植物,其多倍體的誘導(dǎo)與二倍體的純合加倍有所區(qū)別,誘導(dǎo)多倍體時(shí)極易出現(xiàn)嵌合體,且目前已有報(bào)道的是誘導(dǎo)出鱗莖球大于三倍體的六倍體[15]。因此,對(duì)于崇明水仙多倍體的誘導(dǎo)及其最適倍性有待于進(jìn)一步深入研究。

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